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[2018-05-01論文1件追記]ヒト脳オルガノイドを脳に定着させたキメラマウス作出
"An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids" Mansour AA, Gonçalves JT, Bloyd CW, Li H, Fernandes S, Quang D, Johnston S, Parylak SL, Jin X, Gage FH. Nat Biotechnol. 2018 Apr 16

[出典]
  1. Begley S. “Tiny human brain organoids implanted into rodents, triggering ethical concerns” STAT News November 6, 2017.
  2. Begley S. “In a lab pushing the boundaries of biology, an embedded ethicist keeps scientists in check” STAT News February 23, 2017.
  • 11月6日付のSTAT Newsによると(出典1)、11月11-15日にワシントンDCで開催される神経科学会で、2つの研究チームが「移植したヒト脳オルガノイドが、げっ歯類の脳内で、ヒト脳機能を帯びた組織を形作る可能性を提示する」と報告する。
  • 2報告によると、未報告のヒト脳オルガノイド研究で移植後少なくとも2ヶ月間生存したとされている。神経科学会へ要旨を提出したソーク研究所のフレッド・ゲージ(Rusty Gage)によると、マウス脳に移植したヒト脳オルガノイドはマウスの循環系と融合し血管新生に至り、成熟オルガノイドがマウス脳の複数領域に軸索を伸ばすとのことであったが、成熟オルガノイドのサイズや、マウスの”知能”や”行動への影響の有無については現時点では非公開である。
  • ペンシルベニア大学のIsaac Chenらは、STATのインタビューに次のように答えた:2mmサイズのヒト脳オルガノイドを成体ラット脳(2次視覚皮質)に移植し多ところ、少なくとも2ヶ月間生存し、ヒト軸索が盛んにラット脳へと伸びた。軸索の一部は1.5 mmまで伸びて右脳と左脳の間の情報交換を担う脳梁に結合した。 移植したオルガノイドの神経細胞は、視覚刺激に応答して発火した。Chenは、オルガノイド移植による外傷性の脳損傷、脳梗塞、精神障害、神経変性の治療がいつの日か現実になることを、期待している。
  • ゲノムを書く」や「CRISPRによるヒトゲノム編集」などに積極的なChurch研究室では、University Medical Center GroningenからMarie Curie fellowshipにてChurch研究室に加わった生命倫理学者Jeantine Lunshofが、週2回のラボ・ミーティングに参加し、新しい技術やプロジェクトに対して忌憚なくコメントし、議論している。Church研究室では「ヒト脳オルガノイドを血管に結合し、オルガノイドへの血液供給を実現し、ヒト臓器と同等のサイズへと成熟させる」技術についてもすでに議論が行われていたが(出典2)、神経科学会の発表は、CRISPRによるヒト胚編集技術に続き改めて、生命倫理の議論が深められることになろう。例えば、NIHは、NIHのファンドによる「非ヒト脊椎動物の原腸陥入前胚へのヒト多能性細胞の移植」実験研究を認めていないが、ヒトオルガノイドの移植に対しては白紙である。
[脳オルガノイド開発参考文献]
  1. Watanabe M et al. “Self-Organized Cerebral Organoids with Human-Specific Features Predict Effective Drugs to Combat Zika Virus Infection” Cell Rep. 2017 Oct 10;21(2):517-532
  2. Qian X et al. “Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure”  Cell. 2016 May 19;165(5):1238-1254. Epub 2016 Apr 22.

[出典] Preclinical modeling highlights the therapeutic potential of hematopoietic stem cell gene editing for correction of SCID-X1 Schiroli G, ~ Genovese P, Naldini L. SciTransl Med. 2017 Oct 11;9(411). pii: eaan0820.

  • L. NaldiniP. Genoveseら国際研究チームは先行研究(Nature, 2014)で、SCID-X1の病因であるIL2RGinterleukin-2 receptor common γ-chain)遺伝子変異を、修復用cDNAZFNにより標的遺伝子座にノックインすることで、ヒト造血幹細胞・前駆細胞(HSPCs)において機能を有するIL2RGの発現を実現したが、編集した遺伝子座が細胞分化とin vivo免疫応答構築において、野生型の遺伝子発現パターンと機能を完全に再現するかについては不明であった。また、遺伝子編集した少数の前駆細胞が安全かつ効率的に治療効果をもたらすことが可能なのかも不明であった。
  • 今回、Il2rg遺伝子をSCID-X1の病因変異R226Hを有しγ鎖の発現を欠損しているヒトIL2RG遺伝子を替えたヒト化SCID-X1マウスモデルを作出し、SCID-X1遺伝子治療に最適な造血幹細胞・前駆細胞(HSPCs)のゲノム編集プロトコルを探索した。このヒト化SCID-X1マウスモデルは、Il2rg-/-マウスの表現型を再現しリンパ系不全である。
  • はじめに、野生型HSPCsIL2RG/HSPCsの競合的移植アッセイによって、正常な免疫系再構築に必要なHSPCsの下限を探ったところ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)のチャレンジに対して野生型HSPCs 10%LCMVを完全に駆除し、1%ではLCMVの一部を駆除することを見出した。
  • 予期していなかったことに、HSPCs移植前に、全身放射線照射などによる前処理を施すことにより、マウスのリンパ腫発生が抑制されたが、前処理のいかんによらず、10%野生型HSPCsにより免疫系再構築が達成された。
  • SCID-X1マウスモデルにおけるIL2RG遺伝子編集の効果を最大限にする条件をZFNについて探索し、ヒトCD34+ HSPCsIL2RG遺伝子変異修復を、効率的に、極めて高い特異性で、スケーラブルに実現可能な条件を特定した。また、CRISPR/Cas9RNPで送達することでも同等の性能が得られた。

[出典] FACS-Assisted CRISPR-Cas9 Genome Editing Facilitates Parkinson's Disease Modeling Arias-Fuenzalida J, Jarazo J, Qing X, Walter J, Gomez-Giro G, Nickels SL, Zaehres H, Schöler HR, Schwamborn JC. Stem Cell Reports. 2017 Sep 26. pii: S2213-6711(17)30383-1.

  • CRISPR-Cas9とヒトiPSCsの組み合わせは、同質遺伝子疾患モデル作出ならびに疾患関連遺伝子修復の手段として有望である。しかし未だに、ゲノム編集を施したクローン集団から目的とする編集結果を帯びたクローン群を、より高精度、より高効率で、スクリーンする手法が求められている。CRISPR-Cas9による病因変異や病因変異修復のためのノックインは、オフターゲット挿入やオンターゲットでのindels変異などを帯びた目的以外の編集を伴うからである。
  • ルクセンブルグ大学のChristian Schwambornらは今回、ゲノム編集を加えた細胞集団から両アレル変異クローン群を高精度・高効率でスクリーン可能とするプロトコルFACS-assisted CRISPR-Cas9 editingFACE蛍光マーカを利用することで開発し、α-シヌクレイン遺伝子SNCAのエクソン2(e2)とエクソン3(e3)を標的とする実証実験を行った。

FACEベクター構成

  • CAGプロモーター+tagBFP+相同アーム+CAGプロモーター+EGFP-T2A-Puro またはdTOMATO-T2A-Puro+(サイレンス変異を導入したPAMを含む相同アーム)
  • TagBFPはオフターゲット部位へのランダム挿入が起きたクローン群除去を目的とする蛍光タグであり、スクリーン後にpiggybagで除去;EGFPSNCAe2c.209g>a変異を帯びたドナーとSNCAe3c.88g>c変異を帯びたドナーに対応する蛍光タグ;dTOMATOは正常なドナーに対応する蛍光タグ;Puroはピューロマイシン耐性遺伝子;サイレンス変異型PAMは挿入前および挿入後のdsDNA保護のため。

遺伝型およびランダム挿入と反復配列の相関

  • 遺伝型は、ヘテロ型(正常/病因変異)変異、ホモ野生型、及びホモ型変異型の3種類判定
  • 負の選択タグtagBFPによって定量化したランダム挿入頻度に基づいて、反復配列のタイプと相同アームに占める割合などに基づくランダム挿入のモデルを構築し、反復配列の中でもSINEファミリー(AluMir)がランダム挿入に大きな影響を与えることを見出した。

パーキンソン病モデル細胞

  • 多能性幹細胞A13777FACEベクターをエレクトロポレーションし、FACSを介してパーキンソン病変異のp.A30Pまたはp.A53Tを帯びたクローンを得、幹細胞から分化したヒト神経上皮幹細胞においてミトコンドリア不全が起こることを見出した。

1.ヒト結腸オルガノイド遺伝子ノックアウトから、大腸癌の体細胞変異過程を再現

  • [出典1] “Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.” Drost J et al. Science 14 Sep 2017.
  • [出典2] 変異シグナチャー関連論文:Signatures of mutational processes in human cancer. Alexandrov LB Stratton MR. Nature. 2013 Aug 22;500(7463):415-21.Deciphering signatures of mutational processes operative in human cancer. Alexandrov LBStratton MR. Cell Rep. 2013 Jan 31;3(1):246-59.
  • 癌の発生と進行は体細胞変異に依存するところ、膨大な体細胞変異のデータから30種類以上の変異過程のシグナチャー(変異シグナチャー/変異スペクトラム)が見出され(出典2)、癌の病因解明や、診断および予後予測への利用が試みられている。
  • 今回(出典1)、ヒト結腸オルガノイドのDNA修復遺伝子の一種であるMLH1遺伝子をCRISPR/Cas9でノックアウトし、サブ・クローニングと全ゲノムシーケンシング(WGS)により、複製エラーを介して蓄積される体細胞変異を追跡し、ミスマッチ修復機能を損失した結腸癌における主要な変異プロファイルを再現することを確認した。
  • MLH1遺伝子で成果が得られた手法を、塩基除去修復タンパク質をコードし癌素因遺伝子の一つとされているNTHL1に展開した。その結果、NTHL1欠損オルガノイドの変異シグナチャーが、乳癌コホートから見出されていた変異シグナチャー(C > Tのトランジッション変異を特徴とするsignature 30)と一致することを見出した。これまでに、生殖細胞系列にNTHL1両アレル変異を帯びている結腸癌患者のエクソームに見られた変異が主としてC > Tであり、また、signature 30は、WGSによって生殖細胞系列でNTHL1遺伝子が不活性化されている患者から同定されたmutational signatureであったが、今回、この乳癌患者の腫瘍細胞と生殖細胞系列細胞のシーケンシングからもNTHL1欠損とsignature 30のリンクが裏付けられた。

2.ヒト腎臓オルガノイド遺伝子ノックアウトによる腎臓障害疾患の病因遺伝子探索

  • [出典1] Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.” Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, Saad AF, Li MK, Hughes MR, Werff RV, Peters DT, Lu J, Baccei A, Siedlecki AM, Valerius MT, Musunuru K, McNagny KM, Steinman T, Zhou J, Lerou PH, Bonventre JV. Nat Commun. 2015 Oct 23;6:8715.
  • [出典2] “Gene-edited Human Kidney Organoids Reveal Mechanisms of Disease in Podocyte Development..” Kim YK, Refaeli I, Brooks CR, Jing P, Gulieva RE, Hughes MR, Cruz NM, Liu Y, Churchill AJ, Wang Y, Fu H, Pippin JW, Lin LY, Shankland SJ, Vogl AW, McNagny KM, Freedman BS. Stem Cells. 2017 Sep 14.
  • 腎臓形成において、血中タンパク質を濾過し尿を生成するポドサイト(糸球体上皮細胞)の分化が鍵である。先行研究で、ネフロン様腎臓オルガノイドにおいてヒト多能性幹細胞由来のポドサイト(hPSC-podocytes)形成を観察したが(出典1及び挿入図参照)、ポドサイトの発生過程と疾患メカニズムの解明は課題として残っていた。
    Models of hPSC-derived epithelia
  • 今回(出典2)、微細構造解析、生物物理学的解析およびトランスクリプトミクスから、hPSC-podocytesが、in vivoにおけるポドサイト発生段階の毛細血管係蹄形成ステージ(capillary loop stage)をフェノコピーすることを見出した。
  • CRISPR/Cas9によりポドカリキシン遺伝子をノックアウトした変異hPSC-podocytesは、種々の解析とポドカリキシンを欠損し尿生成機能を失ったモデルマウスのポドサイトをフェノコピーすることから、ポドカリキシンがポドサイト形成に必須であると結論した。

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