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[出典] Microscaled proteogenomic methods for precision oncology. Satpathy S [..] Carr SA, Ellis MJ. Nat Commun 2020-01-27. (bioRxiv. 2019-10-09)

 癌のプロテオゲノミクス[*]は、癌のゲノミクスならびにトランスクリプトミクスのデータにプロテオミクスのデータを加えて統合解析する手法であり、癌の生物学と治療標的を深く理解する (deep insights)手がかりを供する [* WikipediaのProteogenomicsの項 から引用した下図概念図参照; Nat Methods 2014]Proteogenomics
 Broad Institute、Baylor College of Medicine、Siteman Comprehensive Cancer Center (WUSTL)などの研究グループは今回、これまでの手法に比べて、極めて少量のサンプルの採取法にサンプル中に微量に存在するタンパク質 (deep proteome)の検出も検出可能なプロテオミクス技術を組合わせることで、トランスレーショナル研究や癌の臨床診断に展開可能なプロテオゲノミクスの手法を開発した。

サンプル採取・調整法とマイクロスケールのプロテオーム解析法

 Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)では、少なくとも100 mgの腫瘍組織を前提として、10,000種類を超えるタンパク質と、サンプルあたり30,000ヶ所を超えるリン酸化サイトのデータを獲得してきた。癌の臨床診断では、急速凍結組織からのコア針バイオプシー (core needle biopsy)で20 mg程度のサンプルをもとに、高深度なプロテオゲノミクスに十分なDNA、RNAおよびタンパク質を抽出する。
  • 研究グループは、高深度なプロテオゲノミクスを行うに足る高品質なDNA、RNAおよびタンパク質の調整を可能とするサンプルを14G (外径 2.11±0.03 mm; 内径 1.69±0.04 mm)の針を介して採取する手法 (Biopsy Trifecta Extraction, BioTExt)を確立した [Fig. 1 a引用下図参照]。Table 1-a
  • またBioTExtに加えて、サンプルあたり25 μgのペプチド量で十分なマイクロスケールのLC-MS/MSによるプロテオームとリン酸化プロテオームの解析を可能とするパイプライン、MiProt、を確立した [Fig. 1 b引用下図参照]。Table 1-b
実証実験
 ERBB2陽性 (HER2陽性)乳癌をモデルとして選択し、患者腫瘍組織移植マウス (PDX)モデルでの予備実験に続いて、14名の患者由来組織について解析を行った。
  • HER2を標的とするヒト化モノクローナル抗体薬トラスツズマブ(ハーセプチン)  によるネオアジュバント(術前補助) 化学療法の開始前と開始後48-72時間にわたって、プロテオゲノミクスを行った。その結果、リン酸化部位として、PDXモデル由来組織と患者由来組織においてそれぞれ>25,000ヶ所と>17,000ヶ所を同定し、11,000種類のタンパク質を同定した。
  • 浸潤巣が完全に消失する病理学的完全奏効 (pathologic complete response, pCR)に達した9名の組織では、ERBB2タンパク質とリン酸化レベルが低減し、mTORの活性も低減することを同定した。
  • pCRに至らなかった (non-pCR)事例について、その原因3種類を同定あるいは推定し、オアジュバント(術前補助) 化学療法に際しての診断の改善と個別化の手ががりとした:
  1. 偽陽性ERBB2事前でのFISHでの判定で陽性であったが、免疫組織化学的方法/IHCで、ERBB2タンパク質の発現は過剰になっていないことを特定。
  2. 疑似陽性ERBB2 - ERBB2は増幅していたが、ERBB2タンパク質の発現レベルとリン酸化のレベルがpCRに比べて低く、また、TOP2Aが発癌ドライバーとして機能している可能性。
  3. ERBB2陽性であるが、ムチン (mucin)タンパク質の過剰発現、アンドロゲン受容体 (AR)シグナル伝達の活性化そしてまたは、癌微小環境における抗腫瘍免疫応答の抑制などにより、耐性を獲得することが示唆された。

DiscovEHRは、Regeneron Genetics Center (RGC)Geisinger Health System (GHS)の共同プロジェクトであり、精密医療の基盤構築を目指して、GHSのMyCode® Community Health Initiativeの参加者から合意を得たコホートを対象とするハイスループット・エクソーム・シーケンシングと生涯医療記録(longitudinal electronic health records: EHRs)の総合的解析を進めてきた。12月23日に、その総合的な報告(以下、1.[論文])と、家族性高コレステロール血症(Familial Hypercholesterolemia: FH)に焦点をあてた報告(以下、2.[論文])がScience から刊行された。
  1. [論文] 大規模な遺伝変異スクリーニングとEHRを突き合わせることで、遺伝型と表現型の相関を広くかつ深く理解することが可能になり、精密医療の基盤充実に至る
    • Corresponding authors: Frederick E. Dewey (RGC); David J. Carey (GHS)
    • DiscovEHRコホートの背景
      • 50,726の成人(主として欧州系);EHR期間中央値 14年;診療回数中央値 87回;臨床試験件数/人 687件;治療行為/人 7回;エクソームシーケンシングを実施した対象の48%に同一コホート内に一親等またはニ親等の親族あり
    • DiscovEHRスタディーの成果概要
      • 〜420万件の一塩基変異(SNVs)とINDELsを同定し、そのうち〜176,000件が遺伝子の機能喪失(Loss of gene function: LoF)をもたらすと推定された。これらの変異の圧倒的多数が稀な変異(アレル頻度1%以下)であり、半分以上がシングルトンであった。一人あたりの稀な機能喪失変異数の中央値は21であった。
      • シーケンシングされた全遺伝子(既知の薬剤標的または高い浸透性を帯びた遺伝疾患の危険因子を含む)の〜92%に稀なヘテロ接合LoF変異が見られ、また、少なくとも一人について、〜7%の遺伝子に稀なホモ接合LoF変異が見られた。
      • 遺伝変異のデータと臨床所見データを付き合わせることで、サイトカイン受容体共通βサブユニット遺伝子(CSF2RB)のLoFと好塩基球数ならびに好酸球との相関など、これまで知られていなかった変異と臨床所見の相関が見えてきた。 また、EHRから得られる各種脂質レベルと稀な変異の間のエクソーム・ワイド関連解析を実施し、G6PC など新規な遺伝子座との相関を見出した。
      • American College of Medical Genetics and Genomicsがその変異同定と報告を推奨している56遺伝子を含む76遺伝子に注目して、コホートに見られる病原性変異を分析し、コホートの3.5%(49名)が76遺伝子に病原性変異を帯びていることを見出した。そのうち32名のEHRには遺伝子変異に相関する疾患に相当する臨床所見が記録されていた。
  2. [論文] FHの遺伝子診断
    • Corresponding author: Michael F. Murray (GHS)
    • FHについては、コレステロール値のモニタが普及しているにもかかわらず、過少診断が続いている。DiscovEHRスタディーの分析から、遺伝型に基づいたFH診断の必要性が明らかになった。
      • FHの多くが3種類の遺伝子(LDLR; APOB; PCSK9)の病原性変異に由来すると見られる。研究チームは今回、FH遺伝子変異が低密度リポタンパク質コレステロール(LDLコレステロール)のレベルと冠動脈疾患(coronary artery disease: CAD)リスクに与える影響を分析した。
      • 229名のエクソーム・シーケンスにおいて、3遺伝子において病原性変異として知られているあるいは推定されている35変異を同定。FH病原性変異のキャリア(以下、キャリア)をEHRデータだけに基づいて判定すると、FHの疑いまたはFHと診断結果が出たのは、その僅かに24%に止まった。
      • キャリアの58%が実際にスタチンを服用していたがそのおよそ半数のLDLコレステロールレベルが十分下がっていない状態であり、処置が不十分であることが示唆された。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/10/16)
  • Corresponding authors: Alice B. PopejoyStephanie M. Fullerton (U. Washington, Seattle)
  • 人類集団の遺伝的背景は多様であり、薬剤は、集団によってその効能が低下したり、さらには、健康被害を生じる可能性を帯びている。一方で、遺伝的背景(主としてSNPsの頻度)と疾患や量的形質との関連を解析するゲノムワイド関連解析(GWAS)の研究対象が長年にわたって欧州系に著しく偏っている。
    • 2009年にGWAS catalogue (NHGRIとEBIが共同で構築・運用)を分析したところ、当時のGWAS373件の対象170万サンプルの96%が欧州系であった。2016年に再分析したところ、欧州系の割合が3,500万サンプル(GWAS 2,511件)の81%へと減少し、非欧州系の割合が増加した。この増加分のほとんどはアジア系の増加によるもので、アフリカ系の増加は2.5%、ラテンアメリカ系とヒスパニック系の増加は0.5%に止まり、各地域原住民の割合はやや減少し、欧州系への偏りが続いていることには変わらない。
    • GWASに対して、近年盛んになってきたエキソーム解析では民族の多様性がいくらか改善されている。国際Exome Aggregation Consortium (ExAC)は、60,000サンプルのデータを集積しているが、欧州系は60.4%であり、アフリカ系が8.6%などとなっている。米国のTrans-Omics for Precision Medicine whole-genome sequencing projectは62,000サンプルのデータを蓄積しているが、欧州系50%、アフリカ系30%などとなっている。
    • 何れにしても、遺伝型と疾患を始めとする表現型の相関に関するデータが欧州系に偏っていることは変わっていない。
    • 欧州系への偏った基礎データは、非欧州系民族において、誤った診断と診療が行われる非精密医療が広がるリスクを高める。また、少数民族のGWASが他民族ににとっても有用な知見を示唆した事例が存在している。
    • 今後、研究現場からファンディングエージェンシーまで全ての階層で意識を変えて、非欧州系のデータを増やさない限り、精密医療は実現しない。
  • [注] COMMENTが掲載されたNature 2016年10月13日号には、人の地域的拡散の観点からの集団遺伝学研究ではあるが、地域的に多様なヒトゲノム解析が報告されている:

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/09/20)
  • Corresponding author: Trey Ideker (UCSD)
  • 殆どの癌には2種類の遺伝子変異が存在する。細胞成長を亢進するか、または、細胞死を回避する変異である。前者に対しては阻害療法が数多く開発されてきたが、腫瘍細胞に細胞死を誘導する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、を修復する療法の開発は困難であった。研究チームは今回、標的を特定の腫瘍抑制遺伝子に定めるのではなく、腫瘍抑制遺伝子とその他の遺伝子の相互作用に注目し、共に欠損することで腫瘍細胞が細胞死に至る遺伝子の組合せ(合成致死(synthetic lethal)をもたらす遺伝子の組合せ)を探索した。
    • はじめに酵母において、遺伝子欠損実験によってヒト癌抑制遺伝子の相同遺伝子とドラッガブルな遺伝子の169,000組の相互作用をスクリーンし、酵母細胞に合成致死をもたらす相互作用を数千まで絞り込んだ。
    • 続いて、関与する合成致死相互作用の数が多い21種類の薬剤について、HeLa細胞における112種類の腫瘍抑制遺伝子変異との合成致死性を評価した。
    • その結果、酵母とHeLa細胞を共に合成致死に誘導する薬剤と遺伝子変異について、既知の組合せ13種類を含む158種類の新規組合せを同定した。
    • トポイソメラーゼRAD17チェックポイント・キナーゼBLMのそれぞれ組合せについては、細胞株およびまたは患者の生存期間との関連について検証したが、172種類すべての検証さらには多様な癌種についての検証には多くの研究チームの協力が必要である。
    • 酵母とヒト腫瘍細胞株で保存されていた合成致死に関わるネットワークCoCaNets(conserved cancer networks)のデータの活用を期待して、すべての関連データをNDEx(The Network Data Exchange)から公開した。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/08/19)
  • Corresponding author: Daniel G. MacArthur (Massachusetts General Hospital/Broad Inst.)
  • Nature 誌2016年8月18日号に、2014年10月20日に一般公開されたエクソーム変異データベースを総合的に解析した報告が掲載された。
  • このデータベースは、Exome Aggregation Consortium (ExAC)プロジェクトとして、14種類のコンソーシウム/コホート由来の配列データから、Genome Analysis Toolkit (GATK) HaplotypeCallerのデータ解析パイプラインで一括してSNVs(1塩基バリアント)とindelsをコールし直し、さらに品質管理を経て集積したエクソーム変異データベースである。
    • 10,195,872件の候補変異から7,404,909件の高品質変異データを抽出、これはエクソーム上で8塩基に1カ所の変異頻度に相当。91,000件のエクソームデータから60,806人のデータが選択された。この規模は1000Genomes(以下、1KG)とExome Sequencing Project (ESP)の規模をはるかに凌ぐ(参考図1a参照)。
    • 40120001
    • 出身は欧州、アフリカ、南アジア、東アジア、およびラテン系アメリカ(参考図1b参照)に分かれるが、東アジアが他の集団から遠いのは、中東と中央アジアが極めて少ないことを反映している。
    • 変異の多くが稀な変異である(参考図1c参照):頻度1%未満が99%;シングルトン(DB中に1件しか存在しない変異)が54%;新奇変異(1KGとESPには存在しないという意味で)が72%
    • CpG→TpGの比率が高い(参考図1d参照)
    • 123,629件の信頼性の高いindelsの95%は、長さが6塩基未満(参考図1e参照)
    • フレームシフト変異はインフレーム変異に比べてより少数であり、シングルトンの比率がより高く、その遺伝子産物の有害性の指標となる(参考図1f参照)
  • ミスセンス変異に対する遺伝子の不寛容性などの詳細な解析を実施
    • ExACの規模で初めてprotein-truncating variants(PTV)に対する遺伝子の不寛容性を評価可能になった。機能喪失型変異に不寛容な3,230遺伝子(言い換えると、必須遺伝子)を同定したが、その72%に対応する疾患表現型がOMIMデータベースにもClinVarデータベースにも見られなかった。
    • 複数の個人に見られる同一の変異はそれぞれ独立に発生しうる(世代を経る間に同一の変異が繰り返し起こる)
    • メンデル型遺伝病の病因とされた変異が、疾患表現型を伴なわないヒトにも高頻度に見られる事例が多々ある。 
      [注] ゲノム解析の結果見出された致死性とされる遺伝子変異が、ExACを参照した医師から"健常人の多くに存在する変異"であることを知らされて安堵したというジャーナリストCarl Zimmerのエピソードが"STAT"に掲載されている
    • PTVsによる遺伝子破壊が集団の間で多様なことを見出した。できる限り多様な多くの集団からのデータを集積することで、'ヒューマン・ノックアウト'の発見 、ひいてはその遺伝子の機能を解析することが可能になる。
  • ExACは一般公開後、国際的に500万回以上利用されており、大規模に集積したすべての配列データを共通のデータ解析プロトコル・パイプラインで処理することの価値を証明している。ExAcは120,000エクソームと20,000WGSを来年中に集積することを目指している。なお、本論文の共著者所属機関の所在国は、米国を圧倒的多数として、メキシコ、カナダ、スエーデン、フィンランド、英国、イタリー、スペイン、パキスタン、韓国ならびにオーストラリアである。
  • 関連Webサイト
  • MacArthurのブログとExAcデータベースを利用した文献
    • [自叙伝] MacArthurがロジスティクス・コンサルタントの職を辞して、生物学・バイオインフォマティクスを学び、本論文に至るまでの経緯
    • [論文] E. V. Minikel et al. “Quantifying prion disease penetrance using large population control cohorts” Sci. Transl .Med. 2016 Jan 20;8(322):322ra9.
    • [論文] R. Walsh et al. “Reassessment of Mendelian gene pathogenicity using 7,855 cardiomyopathy cases and 60,706 reference samples” Genet. Med. Published online 2016 August 17.

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