タグ:蛋白質工学

[出典] "Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs" Inoue A, Raimondi F [..] Russel R. 
Cell. 2019 May 21. pii: S0092-8674(19)30496-9.

背景
  • GPCRsは最大のタンパク質スーパファミリの一つを形成し、細胞外リガンドを細胞内シグナル伝達の活性化へと変換する膜貫通タンパク質群である。これまでに市販されている医薬品の作用標的の30%をGPCRsが占めるに至ったが、引き続き、創薬標的として注目を集めている。
  • GPCRは、リガンドを受容するとそのコンフォメーションを変え、細胞内のヘテロ三量体Gタンパク質複合体と結合・活性化し (共役し)、下流へのシグナル伝達を駆動し、リガンドに対する然るべき細胞応答を実現する。Gタンパク質ヘテロ三量体はGα、GβならびにGγサブユニットで構成され、GαがGPCRとの相互作用および細胞内のシグナル伝達を制御する。
  • ヒトゲノムには、si/oq/11および12/13の4種類に分類されている Gα遺伝子16種類がコードされている。哺乳類のGPCRsそれぞれが一種類以上のGタンパク質と共役する独特のGタンパク質結合プロファイルを備えており、それぞれに特有な細胞応答を担っている。
成果
 東北大学の井上飛鳥と青木淳賢らはハイデルベルグ大学のRobert B. Russelらのグループと共同で今回、2012年に発表したTGFα切断アッセイ(TGFα shedding assay)の手法をもとに、ヒトGPCRs 148種類とGタンパク質 11種類の間の結合プロファイリングを実現した。

 [TGFα切断アッセイ]
TGFα shedding assay PDIS
  • 今回は、TGFα切断アッセイにおいて、内在Gタンパク質をCRISPR-Cas9システムで欠損させたHEK293細胞に、qをベースとする各Gタンパク質とのキメラタンパク質を導入することで、これまでデータが乏しかったグループも含むGタンパク質の活性化、ひいては、GPCRsとGタンパク質との相互作用、の網羅的同定を実現した。
  • キメラGタンパク質を利用するこのアッセイにより、Gタンパク質サブファミリー間のリガンドバイアスの解析も行なった。
 [NanoBiT™-Gタンパク質遊離アッセイ]
  • キメラGタンパク質を組み込んだTGFα切断アッセイを相補するアッセイとして、Gタンパク質活性化の鍵となるプロセスであるGαサブユニットがGβγからの遊離を、NanoLuc® BinaryTechnology NanoBiT™によって判定した。
 [Gタンパク質の選択性を支配するGPCRsのアミノ酸残基]
  • TGFα切断アッセイから得られ結合プロファイルのin silico解析から、Gタンパク質と直接相互作用するアミノ酸残基の他に、細胞膜貫通領域や細胞内ループにGタンパク質選択に重要なアミノ酸残基が存在することを発見した。
 [Gタンパク質結合の予測アルゴリズムの開発とその応用]
  • 前項のデータをもとにした機械学習 (ロジスティック回帰)によりGタンパク質結合の予測モデルを開発し、既存の予測法よりも高精度であることを検証し、GPCRs 61種類の共役Gタンパク質の新規同定も実現した。
  • さらに、予測モデルを用いて、G12に特異的に結合する人工GPCR (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs: DREADD)の設計・作出・実験検証を実現した。
成果関連Webサイト

[出典] "MAFFT-DASH: integrated protein sequence and structural alignment" Rozewicki J, Li Songling, Amada KM, Standley D, Katoh K. Nucleic Acods Res. 2019-05-07
  • 2002年にClustalWT-Coffeeよりも高速であり、今やClustalWのオリジナルWebサイトでも'For DNA alignments we recommend trying MUSCLE or MAFFT'と紹介されているマルチプル配列アライメント (multiple sequence alignment, MSA)ツール、MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform)を発表した加藤和貴 (当時 京大、現 阪大微研)らは、今回、MAFFTに構造アライメントを統合した解析環境MAFFT-DASHを公開 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)するに至った。
  • DASHは、Protein Data Bankに登録されている全てのタンパク質を対象としたドメインとチェインの構造アライメントの結果を蓄積したWebベースのデータベース (web-based Databae Aligned Structural Homologs)である。2019年4月4日更新時の規模が、441,111チェイン, 56,848,571のチェイン・アライメント, 169,937ドメインおよび94,062,584ドメイン・アライメント、となっている。
  • MAFFT-DASHの検証は、ベンチマークデータセットを提供しているBAliBaseHomFamOXFamMattbenchおよびSISY- PHUSから選択した878セットに基づいて行われい、MAFFT-DASHのMAFFTからの性能向上が実証された。すなわち、参照アライメント結果との一致度を見る指標 Sum-of-Pairs(SP)にて、類似性が弱い配列間でのアライメントについて、MAFFT-DASHはMAFFTから10-20%の向上を示した。
  • また、MAFFTアライメントに相同配列を加えると、アライメント結果がさらに改善された。
  • MAFFT-DASHを利用することで、リモートホモロジーの検出を介して、タンパク質構造のホモロジーモデリングのテンプレートとして利用可能な構造既知タンパク質の範囲が広がる。
  • 下図は、MAFFT単独のアライメントでは検出できなかったリモートホモロジーから構造上保存されていた触媒アミノ酸をMAFFT-DASHアライメントによって同定した事例 (Figure 1から引用)MAFFT-DASH.

出典
  • 論文 "De novo design of potent and selective mimics of IL-2 and IL-15" Silva DA, Yu S, Ulge UY, Spangler JB [..] Dougan M, Garcia KC, Baker D. Nature. 2019-01-09.
  • NEWS AND VIEWS "Designer protein delivers signal of choice" Jones EY. Nature. 2019-01-09
  • NEWS "Researchers redesign a cancer-busting protein—without the side effects" Service RF. Science. 2019-01-09. 1:00 PM. 
概要
  • サイトカインIL-2は癌の免疫療法製剤として利用されるとともに、臓器移植に対する応答などの免疫を抑制する製剤の標的分子であり、近年、制御性T細胞活性化の標的分子 (Nat Med, 2018)として注目を集めている。IL-2の創薬にあたっては、IL-2分子の安定性と選択性の向上が課題である。
  • UW SeattleのD. BakerとD-A Silvaや Stanford U. School of MedicineのK. C. Garciaをはじめとする米国・ポルトガル・スペイン・英国の共同研究チームは、IL-2と受容体との複合体の構造と特性を参照し、受容体結合部位の配置を前提として (IL-2Rβγ複合体構造をテンプレートとして)Rosetta softwareによりIL-2に加えてIL-15の模倣分子をデザイン・合成・飽和突然変異誘発・評価を経て、安定性と選択性が高く、より強力で安全なNeoleukin-2/15 (Neo-2/15)に至った  (crisp_bio注:本記事の終わりに、テンプレートとして利用された天然IL-2とβγ受容体の複合体構造をPDBjから引用掲載)。
  • Neo-2/15は天然IL-2への変異誘導からは導出され得なかった新奇構造である。Neo-2/15もIL-2も共に4本のヘリックスバンドルで形成されるが、配列の同一性は14%であり、構造は著しく異なる。例えば、N末端からC末端へのヘリックスバンドルの結合順が入れ替わっている。単独および受容体との複合体構造がそれぞれPDBに6DG6 (Neo-2/15 monomer) と 6DG5 (Neo-2/15 ternary complex with MmIL-2Rβγc)として登録されている。
  • Neo-2/15は、βとγ受容体に高い結合親和性で結合するがα受容体 (CD25)に結合しない選択性を帯びており、大腸癌とメラノーマのモデルマウスにおいてα受容体結合に伴う副作用の低減と腫瘍増殖の抑制効果を示し、腫瘍消失例も観察された。
  • Neo-2/15は、UWからスタートアップ企業Neoleukin Therapeuticsにライセンスされ、治験を目指している。
  • crisp_bio注:D. Bakerらは2018年12月に、Rosettaの水素結合ネットワーク・デザインHBnet機能を利用して2本のαヘリックス・セグメントをDNA二本鎖のように組み合わせた上で、ヘテロ二量体蛋白質をデザイン・合成した論文"Programmable design of orthogonal protein heterodimers"をNature誌に発表していた (crisp_bio注:下図はそのPDB登録構造の一例 (6DMP)を左に、KC Garciaらの2005年PDB公開IL-2Rβγc構造 (2B5I)を右に並べたものでもの;2019-01-13時点で6DG66DG5の構造情報は公開待ち )Baker

crisp_bio注: 2019-01-11 23:52に記事タイトル一部改訂
[出典] 論文 "CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification" Oakes BL,  Fellmann C [..] Doudna JA, Savage DF. Cell. 2019-01-10;[RESEARCH HIGHLIGHT] CRISPR adapted to respond to infected cells - Engineered tweaks to the popular gene-editing system allow it to fight viral infection. Nat Biotechnol. 2019-01-14.

概要
  • UC BerkeleyとLBLNの研究チームは今回、SpyCas9に人為的に循環置換 (circular permutation, 以下 CP)を誘導することで、不活性化した状態からウイルス由来プロテアーゼで活性化することが可能なCas9変異体, ProCas9, を作出し、ProCas9が病原性の植物ウイルスとヒトウイルスを検知し応答することを示した。
CPとは

CP改変Cas9s (以下、Cas9-CPs)
  • 研究チームは、トランスポゾンを利用して、5-20 aaのペプチド・リンカーをもとに循環置換を加え、活性評価を経てCas9-CPsライブラリーを構築した。
  • CPのホットスポットとしてHelical-II (aa 178–314), RuvC-III (aa 940–1150), およびC末端ドメイン (CTD, aa 1240–1299)が同定されたが、Cas9-CPsにおいて新たなN-/C-末端をCas9のDNA結合部位に隣接して配置可能であることから、Cas9-CPsは、DNA修飾酵素、クロマチン修飾因子、デアミナーゼなどの機能ドメインの融合に最適なスキャフォールドとして利用可能である。
Cas9-CPsからProCas9へ
  • Cas9-CPsのペプチド・リンカーとして、病原性の植物ウイルスやヒトウイルスのプロテアーゼの認識モチーフを帯びた配列を利用することで、プロテアーゼによるペプチド・リンカー切断により活性化するCas9 を作出し、ProCas9と命名した。
  • ProCas9は、E. coliおよびヒト細胞において、植物病原性ポティウイルスやヒト病原性のフラビウイルスのプロテーアーゼを検知し、ペプチド・リンカーで抑制されていた活性を発揮することを確認した。
  • 研究チームは、Cas9を介して細胞死を誘導するsgRNAs (以下、CIDE**-sgRNA)を同定した上で、ProCas9にCIDE-sgRNAを組み込みフラビウイルス由来プロテアーゼをシグナルとして利他的細胞死を誘導可能なことも示した(** CIDEはCRISPR- Cas induced death by editingに由来する略号)。

2018-12-03 crisp_bio注:2018-12-04 DeepMind社深層学習の医療応用査読付き論文へのリンク追加

2020-01-31 crisrp_bio追記:
Proteins誌とNature誌の掲載論文とNature誌NEWS AND VIEWSの書誌情報、およびプログラム入手先を追加:
[出典] "Google's DeepMind predicts 3D shapes of proteins" Sample I. The Guardian 2018-12-02.;"AlphaFold: Using AI for scientific discovery" DeepMind NEWS & BLOG. 2018-11-30.
  • ゲノムから転写・翻訳されたペプチド鎖が正しく折り畳まれる(フォールディング)ことで、機能するタンパク質が形作られる。フォールディング不全に相関する疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症など多数知られている。
  • このタンパク質フォールディングは物理法則に基づいて進行するが、その物理法則が完全には解き明かされていないためにアミノ酸配列から理論的に予測することが現状では不可能である。また、与えられたアミノ酸配列からタンパク質が取り得る構造を全て予測し評価する手法によっても、その組み合わせが膨大なため、フォールディングを完全に予測することは現時点では計算不可能である (レビンタールのパドックス/Levinthal's paradox)
  • タンパク質研究コミュニティーでは、タンパク質フォールデング研究振興ひいてはフォールディング予測精度の向上を目指して1994年以来2年ごとにCritical Assessment of Structure Prediction (CASP) コンペを2年ごとに開催してきた。
  • 本年 (2018年)の第13回CASP (CASP13)では、98件のエントリーの中で、深層ニューラルネットワーク (deep natural networks)を基礎とするDeepMindのAlphaFoldがトップに立った (TS Analysis : Group performance based on combined z-scoresのグラフ/テーブルの中のエントリーG043/A7D)。AlphaFoldが43件のタンパク質の中で25件のタンパク質について最も精密な構造を予測したところ、次点の精密構造予測は3件に止まった。
  • 今回のAlphaFoldは、既知のタンパク質構造データでの学習に基づき、新奇ペプチド鎖についてアミノ酸残基ペアの間の距離と残基間の化学結合の角度を予測・評価したのち、機械学習の一手法である勾配降下法 (gradient descent)でエネルギーの観点から最適化した。
参考: DeepMind社からの深層学習医療応用論文

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