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[出典] "A neuron-optimized CRISPR/dCas9 activation system for robust and specific gene regulation." Savell KE [..] Day JJ. eNeuro. 2019-02-25.

概要
  • University of Alabama at Birminghamの研究チームは今回、神経細胞特異的プロモーター (ヒトのシナプシン)のプロモータを利用することで、ラット神経細胞においてCRISPRa (dCas9-VPR)による十分な遺伝子発現活性化を実現した。
In vitro実験
  • ラットの大脳皮質、海馬および線条体由来の初代神経細胞において、遺伝子のクラスやサイズに左右されない遺伝子発現活性化を確認した。また、多重sgRNAsによる単一遺伝子の相乗的な発現活性化や、異なる一連の遺伝子の発現を同時に活性化することも確認した。また、VPRを転写抑制因子KRABに替えたCRSIRPi (dCas9-KRAB)による発現抑制も、転写開始点近傍を標的とすることで可能なことを確認した。
  • シナプスの可塑性、学習および記憶に関与する重要な因子であり複雑な転写調節を受ける脳由来神経栄養因子 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)をモデルとして、特定の転写物を選択的に上方制御することが可能なことを示した。BDNFは、9種類の5'ノンコーディング・エクソン (I-IXa)と、単一のコーディング・エクソン (IX)で構成されている (原論文Figure 3引用下図の a 参照)。neuron CRISPRa
    I-IXaにはそれぞれの上流に独自のプロモーター領域が存在することから、プロモーターの組み合わせによって多様な転写物が生成される。研究チームは、Bdnf IとBdnf IVを標的とするsgRNAによってそれぞれの転写物を独立に上方制御可能であり、また、双方のsgRNAを併用することでBdnf IX転写物を相加的に上方制御されることを示した (上図 b-d 参照)。
In vivo実験
  • CRISPRaをレンチウイルスにより成体ラットの前頭前皮質、海馬および側坐核に注入し、選択的な遺伝子発現活性化を実証した。 
参考crisp_bio記事
  • 2017-05-10 CRISPRiとCRISPRaは、ヒト細胞における遺伝子発現の抑制と活性化を、ゲノムワイドで調節可能にする:設計と実証

1. ヘテロクロマチンがCRISPR-Cas9ゲノム編集に与える影響:変異誘発を遅らせるがDNA修復結果には影響しない
[出典] "Heterochromatin delays CRISPR-Cas9 mutagenesis but does not influence the outcome of mutagenic DNA repair" Kallimasioti-Pazi Em [..] Wood AJ. PLoS Biol. 2018-12-12
  • クロマチン構造がゲノム編集効率に影響を与えると考えられているが、その影響の定量は困難であった。University of EdinburghとCNRS and University of Montpellierの研究チームは今回、CRISPR-Cas9が誘導する変異の頻度とプロファイルを、配列が同一で同じ核に存在する母性アレルと父性アレルの間でアレル特異的クロマチン修飾がCRISPR-Cas9編集に与える影響を定量可能とするインプリンティング遺伝子 (imprinted gene)を帯びたマウスES細胞の実験系(原論文Fig 1引用下図左参照)を開発し、表題の結果を得た。
Heterochromatin 1 Heterochromatin 2
  • ヘテロクロマチンは、Cas9活性が短時間の場合およびCas9細胞内発現レベルが低い場合に、変異誘発を7分の1へと抑制するが、一方で、Cas9によるDSBの修復結果には影響を与えない (原論文Fig. 5引用上図右参照)。
2. CRISPRaによるPTEN腫瘍抑制遺伝子の発現活性化と抗癌作用
[出典] "Activating PTEN tumor suppressor expression with the CRISPR/dCas9 system" Moses C [..] Blancafort P. Mol Ther Nucleic Acids. 2018-12-14.
  • 癌細胞で見られるPTEN発現不全は、変異、転写抑制および遺伝子サイレンシングなどに起因する。
  • オーストラリアHarry Perkins Institute of Medical Researchの研究者等は今回、PTEN近位プロモーターを標的とするdCas9-VP64-p65-Rta (VPR)-sgRNAにより、メラノーマ細胞株とトリプルネガティブ乳癌細胞株において、sgRNAの推定オフターゲット部位における転写に影響を与えることなく、PTEN発現の亢進を実現した。
  • その結果、下流の発癌パスウエイが抑制され、B-RafまたはおよびPI3K/mTORの阻害剤の存在下で、マラノーマ細胞株の遊走が抑制されコロニー形成が阻害された。
3. FTLD患者由来iPSCから誘導したニューロンとCRISPR/Cas9で変異を修復したニューロンの比較から、FTLDの病因となる微小管結合タンパク質タウ遺伝子変異の機能を解析 (#神経変性)
[出典] "Integrative system biology analyses of CRISPR-edited iPSC-derived neurons and human brains reveal deficiencies of presynaptic signaling in FTLD and PSP" Jiang S [..] Harari O, Cruchaga C, Karch CM. Transl Psychiatry. 2018-12-13.
  • 微小管結合タンパク質タウ (microtubule-associated protein tau, MAPT遺伝子の変異がタウを伴う前頭側頭葉変性 (FTLD-tau)の病因である。Washington University in St. Louisを中心とする優性遺伝性アルツハイマー・ネットワーク (Dominantly Inherited Alzheimer Network, DIAN)とInternational FTD-Genomics Consortium (IFGC)は、FTLD-tauにおいて不全となっている遺伝子とパスウエイの同定を試み、今回その成果をTranslational Psychiatry誌で報告した。
  • 原論文Fig. 1引用下図にあるように、FTLD and PSP
    MAPT p.R406Wキャリア患者由来iPSCから誘導したニューロンと、CRISPR/Cas9で遺伝子変異を修復したアイソジェニックなニューロンのトランスクリプトームの比較から、発現に有意差がある328遺伝子を同定した。
  • ニューロンの比較から同定した遺伝子の中で61遺伝子は、脳組織においてもニューロンの場合と同様な差異を示し、また、GABA受容体を含むパスウエイとシナプス前の機能にエンリッチされていた。
4. ファンコーニ貧血症の分子機構解析の基盤となるゼブラフィッシュ変異体の作出
[出典] "Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated knockout of 19 Fanconi anemia pathway genes in zebrafish revealed their roles in growth, sexual development and fertility" Ramanagoudr-Bhojappa R, Carrington B [..] Chandrasekharappa C. PLoS Genet. 2018-12-12
  • ファンコーニ貧血に関与する19遺伝子をCRISPR/Cas9でノックアウトしたゼブラフィッシュ変異系統36種類を作出し、各遺伝子が成長、性決定および繁殖に果たす機能の解析に利用
5. CRISPR/Cas9による原発性高シュウ酸尿症I型 (PH1)疾患モデルラット作出
[出典] "Generation of a primary hyperoxaluria type 1 disease model via CRISPR/Cas9 system in rats" Zheng R, Fang X, He L, Shao Y, Guo N, Wang L, Liu M, Li D, Geng H. Curr Mol Med. 2018-12-11
  • ミトコンドリアに局在するアラニン:グリオキシレート アミノトランスフェラーゼ (alanine-glyoxylate aminotransferase, AGXT)遺伝子アイソフォームをCRISPR/Cas9でノックアウトすることでグリオキシル酸代謝を阻害
6. アーケアでは種間交雑を介したスペーサ獲得が広がることで、CRISPR/Casシステムが種間遺伝子伝播の阻害と種分化に貢献することが示唆された
[出典] "Pervasive acquisition of CRISPR memory driven by inter-species mating of archaea can limit gene transfer and influence speciation" Turgeman-Grott I [..] Gophna U. Nat Microbiol. 2019 Jan;4(1):177-186. Online 2018-11-26
  • アーケアは近縁種のハウスキーピング遺伝子を含む染色体遺伝子にマッチするスペーサを帯びており、環境中の同一サイトのアーケア各種はスペーサを共有し、Haloferax volcaniiHaloferax mediterraneiの交雑実験でも染色体全体にわたってスペーサが獲得される。
7. CRISPRノックアウトスクリーニングによりクラミジア・トラコマチスの侵入に必須な宿主因子コートマータンパク質 (COPI)を同定
[出典] "A FACS-based genome-wide CRISPR screen reveals a requirement for COPI in Chlamydia trachomatis invasion" Park JS, Helble JD, Lazarus JE, Yang G, Blondel CJ, Doench JG,
Starnbach MN, Waldor MK. iScience. 2018-12-10.
  • Cas9発現ヒト結腸腺癌由来H29細胞にプール型sgRNAsを導入し、mCherryを帯びたC. trachomatisの感染をFACSで判定し、既知の病原体受容体ヘパラン硫酸に加えて、コートマー複合体I (COPI)がC. trachomatisの宿主侵入に必須と同定
  • COPIは細胞表面への病原受容体提示を誘導するとともに、C. trachomatisのIII型分泌装置 (T3SS)を活性化する。

crisp_bio注:2019-01-18 書誌情報の更新と追加
[出典] "CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency" Matharu M, Rattanasopha S, Tamura S, Maliskova L, Wang Y, Bernard A, Hardin A, Eckalbar WL, Vaisse C, Ahituv N. Science 2019 Jan 18;363(6424):eaau0629 Online 2018-12-13. ("CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency" Matharu M, Rattanasopha S, Maliskova L, Wang Y, Hardin A, Vaisse C, Ahituv N. bioRxiv. 2017-05-22);[PERSPECTIVE] "Gene therapy for pathologic gene expression" Montefiori LE, Nobrega MA. Science. 2019-01-18.

ハプロ不全 (haploinsufficiency)と遺伝子治療
  • 神経疾患、発達障害、免疫疾患、代謝異常、不妊症、腎臓障害、四肢奇形など広範な疾患の病因が、相同染色体に由来する遺伝子2コピーの一方のコピーが不活性になり、遺伝子発現量が著しく低減することで発症するハプロ不全症とされ、660種類を超えるハプロ不全遺伝子が同定されてきた。また、最近の大規模なエクソームシーケンシング解析(Nature, 2016)から、ハプロ不全遺伝子は3,000種類を超えるとされた 。
  • ハプロ不全症に対して、外来遺伝子を組み換えAAV (rAAV)で送達することで然るべき遺伝子発現量を確保する手法が試みられてきたが、異所性発現や、遺伝子発現回復用外来遺伝子のサイズがrAAVの許容範囲に収まらない対象遺伝子が多々ある、といった課題を伴っていた。CRISPR遺伝子編集による修復には、変異ごとにCRISPR-Casシステムを設計する必要があり、また、光学顕微鏡では観察できないが複数遺伝子にもわたるヘテロ型機能喪失染色体微小欠失 (microdeletion)の修復には適用が困難であり、オフターゲット編集の問題も完全には解決していない。
肥満モデルマウスでのCRISPRa遺伝治療概念実証実験
  • UCSFの研究チームは今回、量的形質である肥満をハプロ不全症のモデルとして、通常のCRISPR/Cas9遺伝子編集と異なり二本鎖切断過程を経ることのないCRISPRaによってハプロ不全症を治療可能なことをマウスにおいて実証した。CRISPRaはLei S. Qi (当時)を含むJ. S. WeissmanらのUCSFの研究者が中心になって開発した技術である (crisp_bio記事 2017-05-10 CRISPRiとCRISPRaは、ヒト細胞における遺伝子発現の抑制と活性化を、ゲノムワイドで調節可能にする:設計と実証"参照 )
  • 具体的には、single-minded family bHLH transcription factor 1(Sim1)またはメラノコルチン4受容体 (Mc4r)のハプロ不全に起因する肥満を対象として概念実証実験を行った。ヒトのSIM1ハプロ不全は過食と肥満を、Sim1ヘテロ型変異マウスも過食と肥満を呈するがヒトSIM1の過剰発現により正常化することが知られている。
  • Sim1(+/-)マウスにおいて、Sim1のプロモーターまたはその~270 kb遠位に位置するエンハンサーを標的とするsgRNAに基づくCRISPRaよりSim1の発現を上方制御しSim1ハプロ不全に起因する肥満をレスキューした。
  • Sim1の上方制御がプロモーターまたはエンハンサーが活性な組織に限定されており、sgRNAの標的としたシスエレメントが組織特異性を決定していることが示唆された。
  • RNA-seqとChIP-seqからも、オフターゲット編集非検出の高い組織特異性を確認した。
  • CRISPRaシステムをrAAVでマウスの視床下部へ送達することで、Sim1(+/-)マウスの過剰な体重増加を抑制することも確認した。
  • ヒトMC4Rのヘテロ型変異は重症肥満の主因であり、マウスのMc4rのハプロ不全も肥満に至る。Mc4r (+/-)マウスにおいても、Mc4rのプロモーターを標的とするCRISPRaのrAAVを介した視床下部への到達による体重抑制効果を確認した。
展望
  • CRISPRaは、ハプロ不全およびその他の遺伝子量の異常が原因となる機能不全の治療手段として有望である。
CRISPRa 関連crisp_bio記事 (2018年後期)

1. 新たな転写活性化法dCasEV2.1 (EDLL-dCas9-MS2:VPR)
[出典] "Strong gene activation with genome-wide specificity using a new orthogonal CRISPR/Cas9-based Programmable Transcriptional Activator" Selma S [..] Orzaez D. bioRxiv. 2018-12-04.
  • 合成生物学 (SynBio)は、互いに直交する調節回路を組み合わせて植物の代謝プログラムと発生プログラムの書き換えを目指している。SynBioの有望なツールとして近年、自律的活性化ドメイン (ADs)をdCas9に融合することで転写活性化を実現するプログラム可能な転写活性化因子 (Programmable Transcriptional Activators (PTAs)/CRISPRa)の開発が進んできた。
  • Universidad Politécnica de Valenciaの研究チームは今回、活性化を画期的に向上させるdCas9-PTA, dCasEV2.1, を開発した。
  • ADs7種類についてSunTag方式、scaffold RNA (scRNA)方式 (gRNA2.0またはgRNA2.1)およびscRNA方式の4種類のdCas9との組み合わせ方を評価し、EDLLとVPRの2種類のADsをscRNA (gRNA2.1)方式でdCas9に融合するdCasEV2.1に到達した。
  • ベンサミアナタバコにおいて実証実験:dCasEV2.1の転写活性化率は標的プロモーターの本来の活性に依存するが、天然では活性が低いジヒドロケンペロール-4-レダクターゼ(DFR)の活性を10,000倍まで向上した;トランスクリプトミクスから、標的選択性がゲノムワイドで十分高いことを確認した。
 転写活性化関連crisp_bio記事
2. SgRNAの化学修飾によるCas9編集の効率向上
[出典] "Extensive CRISPR RNA modification reveals chemical compatibility and structure-activity relationships for Cas9 biochemical activity" O’Reilly D, Kartje ZJ [..] Damha MJ,  Gagnon KT. Nucleic Acids Res. 2018-12-04.
  • CrRNAの一部をDNAに置換えたキメラ・ガイドがCas9の生化学的活性を亢進することを報告した (CRISPRメモ_2018/05/16 - 2の第3項参照) Southern Illinois UにMcGill Uが加わった研究グループは今回、SpCas9 CRISPR RNA (crRNA)の糖‐リン酸主鎖に広範な化学修飾を加える(原論文Figure 1引用下図参照)実験を行った。chemical modifications
  • その結果、Cas9の活性化の観点からは、crRNAガイドの'seed'領域はA型の螺旋構造に適合する化学修飾を好むが、tracrRNAと結合する領域は、DNA, 2′F-ANAおよび2′,5′-RNAを含むより広範な化学修飾を許容するなど、CRISPR-Cas9活性との化学的適合性と構造活性相関の法則が見えてきた。
3. タイプI-A CRISPRシステムにおいて、Cas4がスペーサ獲得と標的切断に関わる
[出典] "Cas4 nucleases can effect specific integration of CRISPR spacers" Zhang Z, Pan S, Liu T, Li Y, Peng N. bioRxiv. 2018-12-08.
  • 華中農業大学の研究チームはこれまでに Sulfolobus islandicus I-A CRISPR-Casシステムの分子機構解明に取り組み、Csa3aタンパク質がCCN PAM依存でCRISPRスペーサ獲得を誘起することを明らかにしたが、プロトスペーサ選択やスペーサのCRISPRアレイへの挿入の機序は不明であった (文献*,**:(*) Figure 7を引用した下図左と(**) Figure 6を引用した下図右参照:
Type I-A CRISPR–Cas 1 Type I-A CRISPR–Cas 2
  • (*) "Transcriptional regulator-mediated activation of adaptation genes triggers CRISPR de novo spacer acquisition" Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(2):1044-55. Online 2015-01-07.;(**) "Coupling transcriptional activation of CRISPR–Cas system and DNA repair genes by Csa3a in Sulfolobus islandicus" Liu T, Liu Z, Ye Q, Pan S, Wang X, Li Y, Peng W, Liang Y, She Q, Peng N. Nucleic Acids Res. 2017 Sep 6;45(15):8978-8992.
  • 研究チームは今回、Cas4ファミリーのCas4とCsa1が、プロトスペーサの5' PAMと3'ヌクレオチド・モチーフならびにスペーサの長さと方向決めに、決定的な役割を果たすことを明らかにし、さらに、Cas4タンパク質の中でこの機能の鍵となるアミノ酸を同定した。
  • Cas4とCsa1の過剰発現と、Cas4タンパク質がコードされているSulfolobusファージとが、アダプテーション (スペーサ獲得・組込)の効率を顕著に低減し、前者が、PAMに依存する非定型的スペーサ組込またはPAMに依存しないスペーサ組込を高頻度で誘導し、後者がスペーサ獲得を阻害することを同定した。また、プラスミド感染実験において、侵入DNAが、Cas4の過剰発現を介したスペーサ獲得・組込の不全により、CRISPR-Cas干渉 (免疫応答)を逃れることが示唆された。
4. 子ブタのブタ伝染性下痢ウイルス (PEDV)への感受性低減 - CMP-N-N‐グリコリルノイラミン酸水酸化酵素遺伝子 (CMAH)を標的とするCRISPR/Cas9により、N‐グリコリルノイラミン酸の発現を阻害
[出典] "Lessening of porcine epidemic diarrhoea virus susceptibility in piglets after editing of the CMP-N-glycolylneuraminic acid hydroxylase gene with CRISPR/Cas9 to nullify N-glycolylneuraminic acid expression" Tu CF, Chuang CK, Hsiao KH, Chen CH et al. bioRxiv. 2018-12-05.
  • 受精卵にCMAHを標的とする一対のsgRNAsとCas9 mRNAをマイクロインジェクションし、CMAHの両アレルノックアウト・ファウンダーを作出;CMAHのKOはPEDV対する免疫をもたらさないが、PEDVの発症を遅らせ症状を軽減する
5. [論説] ナノ磁石によるCRISPR-Cas9ゲノム編集の局所的制御法*:実用にはオフサイトの編集や磁場の加え方や組織内への浸透性など解決すべき課題が多々ある
[出典] ”Magnets make target cells more attractive to CRISPR” Nance EA. Sci Transl Med. 2018-12-05.
(*) CRISPRメモ_2018/11/19-1 1. ナノ磁石を介してin vivo CRISPR-Cas9ゲノム編集の空間的制御を実現

1. プール型CRISPRaにより抗体および内因性リガンドに対する細胞表面受容体をハイスループットで同定
[出典] "Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation" Chong ZS, Ohnishi S, Yusa K,  Wright GJ. Genome Biol. 2018 Nov 26;19(1):205.
  • CRISPRa (dCas9と転写活性化因子を融合したシステムによる遺伝子転写活性化 (原論文Fig. 1から引用した下図左 a)を利用することで、細胞表面受容体の過剰発現を実現 (下図左b参照)
Receptor-ligand 1 Receptor-ligand 2
  • 膜貫通領域を帯びていることが予測されているタンパク質をはじめとして細胞膜と相関するエビデンスがあるタンパク質をコードする全ての遺伝子のプロモーターを標的とするプール型sgRNAsのライブラリーを構築し、CRISPRaでのゲノムワイドスクリーニングを実現 (原論文Fig. 2から引用した上図右参照);低親和性の受容体-内因性リガンド相互作用同定、創薬標的でありながら活性化リガンドがほとんど同定されていないAdhesion型GPCRsのリガンド同定 (ミエリンインヒビターNogoタンパク質のリガンドADGRB1を同定)
2. [特許] HNHまたはRuvCを不活性化したCas9ニッカーゼ一対の利用による精密ゲノム編集
[出典] US2018/0327761 "Method for Producing Precise DNA Cleavage using Cas9 Nickase Activity". 
公開日 11/15/2018;発明者 Duchateau P, Bertonati C;権利者 Cellectis (Paris, FR) 

3. ヒト細胞におけるゲノムワイドCRISPR-Cas9機能喪失スクリーンにより、志賀毒素とリシンの毒性を仲介する宿主因子として、新たにゴルジ体タンパク質を同定 (原論文Fig.1引用下図 F参照)
[出典] "Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation" Tian S [..] Dong M. PLoS Biol. 2018 Nov 27;16(11):e2006951.
Shiga-ricin
4. ティラピアのノンコーディング配列を高効率で標的するCRISPR/Cas9システム
[出典] "High Efficiency Targeting of Non-coding Sequences Using CRISPR/Cas9 System in Tilapia" Li M, Liu X, Dai S, Xiao H, Wang D. G3 (Bethesda). 2018 Nov 27.
  • Cas9と1~2gRNA(s)によりマイクロRNAと3'UTRも含むノンコーディング配列の選択的欠損をティラピアで実現;受精卵において2箇所の遺伝座の間の断片を一対のgRNAsとCas9により11%の効率で実現し、さらに、ssDNAをドナーとすることで、効率を19%へと向上;次世代への伝達効率平均8.7%を達成し、vasa 3'UTRを標的とするCas9により伝達効率14.8%へと向上
5. 新奇CRISPR-Cas12bによるヒトおよびマウスゲノム編集
[出典] "Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering" Tang F, Cui T [..] Wei L. Cell Discovery. 2018-11-27.
  • Cas12b (C2c)は40 °Cより高温で活性を示すとされていたが、中国科学院の研究チームは今回、Cas12aと異なり31 °C–59 °Cと広い温度域で活性を示すCas12bをAlicyclobacillus acidiphilusから同定した。この AaCas12bは、Cas12aと異なりcrRNA/tracrRNA二重鎖で誘導され、5′-TTNをPAM配列とし、切断部位に粘着末端をもたらす。
  • AaCas12bによる多重ゲノム編集、遺伝子活性化および遺伝変異マウスモデル作出を実証し、全ゲノムシーケンシングではオフターゲット編集が検出されないことを確認した。
  • AaCas12bは、広い温度域に加えて広いpH値域で活性を示し、また、そのRNPがヒト血漿内で安定しているという特徴を備えている。

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