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[出典] China’s CRISPR babies: Read exclusive excerpts from the unseen original research. Regalado A. MIT Technology Review. 2019-12-03
 2018年11月下旬にNatureJAMAに送られたと思われ、未発表のままの原稿を、法学者 (Hank Greely, Stanford U.)、不妊治療医 (Jeanne O’Brien, Shady Grove Fertility)、発生学者 (Rita Vassena, Eugin Group)ならびに遺伝子編集の専門家 (Fyodor Urnov, IGI/UC Berkeley)のチームで査読し、チームからのコメントを対応する原稿の一部 (キャプチャ画面)とともに、MIT Technology Reviewが公開した。

1. 産科医が著者に含まれていない。(出典の第1項と第7項を、ここでは、第1項に一体化)
 著者は、南方科技大学の賀建奎研究室のメンバーにAIDS支援ネットワークの代表Hua Bai生化学とゲノム工学を専門とするライス大学Michael Deemが加わった10名であり、被験者両親に直接接触していたはずの産科医が含まれていないのは何故か。プライバシーの保護のためなのか、何かを隠蔽するためなのか。
 Wall Street Journalの報道 (2019-05-10 12:44 pm ET)によると、研究グループから渡った血液サンプルがすり替えられていたとのことであり、 産科医は、何が進行しているのか、知らされていなかった可能性もある。

2. 著者らのデータ自体が、著者らの主張に反している (出典の第2項, 第5項および第13項を、ここでは、第2項に一体化)
 HIV耐性のヒトを生み出したと主張しているが、誘導された変異は、HIV耐性をもたらすとされているCCR 5 Δ32変異ではなく、HIV耐性をもたらすか否か不明は新たな変異であった。
また、CCR5遺伝子に両アレル変異がもたらされた胚は一つであり、他は、ヘテロ型変異であった。
 香港サミットなどで公開され、原稿に“supplementary”として付されているデータはモザイクに至ったことを示しているが、テキストにはモザイクに関する議論が無い。

3. 胚の遺伝子編集はHIVの感染抑止法として非現実的、特に、感染が最悪の状態の地域では。

4. 両親が同意するに至ったのは、一部では、不妊治療を受けるためであったのではないか。
 原稿自身にも書かれているように、HIV患者である父親からのHIV感染は、体外受精 (IVF)においてほぼ20年安全に利用されてきた精子洗浄によって防止できることから、胚ゲノム編集をする必要は全く無い。将来のHIV感染防止という目的も、胚ゲノム編集を正当化するには至らない。

6. オフターゲット編集
 原稿では、オフターゲット編集は1箇所であったとしていたが、なによりも、双子が由来する胚はオフターゲット編集が検証された胚ではなく、双子におけるゲノム編集の精度が評価されていない。また、胚を構成する全ての細胞のオフターゲット編集を、非破壊的に判定することは、そもそも、不可能である。

8. 双子の誕生時期が改竄されていた
 これも両親と双子のプライバシー保護を目的としてであろうが、双子は原稿にある11月ではなく、関係者によると10月誕生であった。

9. 適切な倫理的レビューが行われた不明
 原稿では、2017年3月にShenzhen Harmonicare Women's and Children's HospitalのMedical Ethics Committeeで実験計画が承認されたとし、http://www.chictr.org.cnに登録したと、簡略に記されているが、登録は、双子が誕生後のことであった。

10. HIVに対する免疫が有効か否かの前臨床試験を行っていない。
 原稿では、双子由来のCD4陽性T細胞のHIV暴露実験を行う予定 (will)としている。

11-12. 著者の役割分担、米国研究者も含む支援者や協力者、資金提供者、利益相反について、記述が無いまたは曖昧


[crisp_bio注]
  • 専門家チームは、論文原稿に基づいて、改めて、研究倫理の上でも生命倫理の上でも「胚ゲノム編集をすることを最優先とした無謀な実験」と判定したように思われる。
  • CRISPRbabies関連crisp_bio記事:2019-08-02 'CRISPRbabies'に至るまでと'CRISPRbabies'のこれから

1. [ハイライト] CRISPRシステムは免疫に加えて転移にも貢献する
[出典] [Dispatch] Transposition: A CRISPR Way to Get Around. Dimitriu T, Ashby B, Westra ER. Curr Biol. 2019-09-23.
  • バクテリアのゲノムにコードされているCRISPRシステムはバクテリアの獲得免疫応答システムとして知られている。
  • バクテリアゲノム内のTn7様トランスポゾン内にもCRISPRシステムがコードされていることが知られていたが、このTnsEホモログを欠損しているトランスポゾンとスペーサ獲得と標的切断を担うCasタンパク質を欠損しているCRISPRシステムが協働して、プラスミド上のcrRNA標的部位の下流への転移を実現することが (CRISPR-guided transposition)、2019年6月にScience誌とNature誌に相次いで報告された [1-2]。
  • 著者らは2論文をハイライトし、CRISPR-guided transpositionの応用および機能獲得の進化過程について考察を加えた。
関連crisp_bio記事
2. 胚ゲノム編集に関する社会的責任のある議論に向けて (#CRISPRbabies)
[出典] CRISPR in context: towards a socially responsible debate on embryo editing. Morrison M, de Saile S. Palgrave Commun. 2019-09-24.
  • 著者らは、バイオテクノロジーの応用としての生殖補助医療 (Assisted Reproductive Technologies: ART)の歴史を振り返り、'CRISPR babise'を単独の逸脱行為としてではなく、その文脈の中で議論すべきとし、具体的に、技術的課題と倫理的課題の切り分け、生殖産業がサービスを提供する可能性の観点から考察を加え、Mary Douglasの ‘matter out of place’の概念に基づいた新奇バイオテクノロジーに対するコンセンサスのあり方についても考察を加えた。
3. [プロトコル] SHERLOCK (#CRISPRdx)
[出典] SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. Nat Protoc. 2019 Oct;14(10):2986-3012. Online 2019-09-23.
# 2020-02-07 crisp_bio追記: BOX1の中のComparison of Cas13 and Cas12 orthologsにおけるsensitivityの数値修正 (HTMLとPDF上では修正済) Author Correction: SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protocol 2020-01-31
  • SHERLOCKは、試料から抽出したDNA/RNAをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法(RPA/RT-TPA)で増幅しT7でRNAへと転写し、このRNAをcrRNAが認識することでCas13-crRNAが発揮するコラテラルRNA分解活性により、消光状態であったレポータ分子からの蛍光発光を誘導することで、標的核酸を超高感度かつ短時間で検出可能とした手法である。
  • 開発グループが今回、LwaCas13aの発現と精製、crRNAsのIVT、臨床資料からDNA/RNA抽出、等温増幅プライマー、多重化および定量アッセイの留意点など、プロトコルを詳細に解説。
4. [プロトコル] C. elegansのCRISPR-Cas9ゲノム編集 (2006年版からの改訂)
[出典] CRISPR‐Cas9‐Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Kim HM, Colaiácovo MP. Curr Protoc Mol Biol. 2019-09-24.
  • gRNAの設計とクローニング、HR修復用テンプレート作成、送達法、およびマーカ不要のトランスジェニック個体のスクリーニング法
5. CRISPR/Cas9によるダイズのゲノム編集を効率化する多重プロモータを選定
[出典] Enhancing the CRISPR/Cas9 system based on multiple GmU6 promoters in soybean. Di YH, Sun XJ [..] Zhao SS, Zhang H. Biochem Biophys Res Commun. 2019-09-23.
  • ダイズのゲノムに内在する11種類のU6プロモーターについて、短縮型β-グルクロニダーゼの発現を効率的に誘導する5種類を同定し、3種類の内在遺伝子の発現を効率的に (~20%)誘導する2種類を同定した。
6. [レビュー] CRISPR/Cas技術が植物のバイオロジーと育種を加速
[出典] [REVIEW] CRISPR/Cas brings plant biology and breeding into the fast lane. Schindele A, Dorn A, Puchta H. Curr Opin Biotechnol. 2019-09-23.
  • CRISPR/CasによるRNA編集; CRISPRa/iおよびBE; 組織特異的Cas発現によるターゲッティング効率向上; 染色体再配置; 野生種からの遺伝的多様性の拡大と栽培化加速
7. CRSISPR-Cas9による植物ゲノム編集に利用されるsgRNAとSpCas9のバイナリーベクタのクローニング
[出典] A zero-background CRISPR binary vector system for construction of sgRNA libraries in plant functional genomics applications. Yun JY, Kim ST, Kim SG, Kim JS. Plant Biotechnol Rep. 2019-09-24
  • sgRNAのスキャフォールドにAarI認識部位で囲んだ細胞毒性を帯びたccdbカッセット導入するpZeroBG-CRISPRバイナリーベクタシステムを開発し、意図しないクローニングが発生したベクターを帯びた大腸菌の除去を実現
8. [レビュー] ゲノム編集 (Genome Engineering, GE)植物の野外実験
[出典] Genome-edited plants in the field. Metje-Sprink J, Sprink T, Hartung F. Curr Opin Biotechnol.2019-09-23.
  • 中国におけるイネをはじめとして、日本、米国、英国、ベルギーにおける種々の作物を対象とするゲノム編集野外実験の事例をまとめ、栽培特性、環境リスク、規制について議論

1. これまで語られなかった賀建奎にとっての'信頼の輪'
[出典] "The untold story of the ‘circle of trust’ behind the world’s first gene-edited babies" Cohen J. Science 2019-08-01
  • Science誌スタッフライターのJon Cohenの記事のタイトルにある'circle of trust'は、Heの広報を担当していたRyan Ferrellの言葉の"He's circle of trust"に由来し、「胚ゲノム編集の行為自体には関与していなかったが、事が公になる前から、賀建奎の行為を知っていたまたは怪しんでいた科学者 (ノーベル賞受賞者を含む)、経営者、起業家、NASEM報告関係者、IVF専門医ならびに政治家」の'輪'を意味している。'輪'の何人かはHeの計画を厳しく批判したが、他は、歓迎あるいは沈黙した。
  • Heを知る人々の何人かはScienceに対して、「Heの秘密を打ち明けられる人 (confidantes)の輪がどのように形成され、科学コミュニティーと一般社会との間のより大きな輪がどのように壊れたか」を明らかにすべきとした。
  • Heの計画を止めさせようとしたスタンフォード大学の生命倫理学者William Hurlbutは、「Heは彼が信頼していた人々から裏切られた (was "thrown under the bus")」「(関係者は)出口に殺到しているが("ran for the exit")、何を知っていたか、何をしたか/何をしなかったか」を公にした上で、「どうしてよいかはっきりしたことはわからない、誰も来たことのない道なのだから」とすべきである、とコメントした。
  • Cohenは、Henの故郷での生活から始まり、合肥市の中国科学技術大学、米国Rice大学 (Deem研)、Stanford大学 (Stephen Quake研)、深圳市南方科技大学、 深圳市のPeacock planから600万US$の資金を得てDirect Gemomics設立の経緯を辿り、Direct Genomicsからの輪の拡がりを明らかにた。
  • また、2017年6月10日深圳市南方科技大学にて、賀建奎が不妊の問題を抱えていた夫婦を胚ゲノム編集へ誘導する50分間の会合 (Science誌はそのビデオの一部を確認済み)を経て、その17ヶ月後の2018年11月の上海第2回ヒトゲノム編集国際サミットに至るまで、'輪'の内外の関係者とのやろとりを詳らかにした。
2. LuLuとNanaが引き受けさせられたこと
[出典] Did CRISPR help—or harm—the first-ever gene-edited babies? Cohen J. Science 2019-08-01.
  • Heの胚ゲノム編集は、HIV患者の父から子へのHIV感染防止とHIVに対する耐性をもたらすことを目的としたとされている。しかし、父から子へのHIV感染防止は、ゲノム編集を行うまでもなく精子洗浄によって可能である。
  • HIV耐性の遺伝型として北欧集団の中からCCR5遺伝子のホモ型32-bp欠損CCR5Δ32が知られているが、CCR5にはHIV以外のウイルスに耐性をもたらす、CCR5Δ32は短命になる傾向がある、などCCR5およびCCR5Δ32の生物学的意味が定まっていない。
  • Heらは32-bpの欠損ではなく、その一部の15-bpの削除を目指したが、CCR5Δ15がもたらす可能性があるタンパク質の機能は不明である。
  • Heらの胚ゲノム編集結果はヘテロ型CCR5変異であり (CCR5全長アレルが1コピー存在)、また、モザイク (両アレルともCCR5全長)が発生したと推定される。
  • LuLuとNaNaのその後の健康状態は不明なままである。
関連crisp_bio記事

1. HIV予防法とされているCCR5-∆32変異は、76歳までに死亡する率を高める
# crisp_bio 2019-06-05 追記: 本論文については再解析に基づいた問題点がTwitter上で指摘されている。
# cirsp_bio 2019-08-28 追記: "Major error undermines study suggesting change introduced in the CRISPR babies experiment shortens lives" Robbins R. Stat News. 2019-09-27.
# crisp_bio 関連記事:2019-10-01 CCR5-∆32変異が76歳までの死亡率を高める」を巡る議論結着に向かう
[出典] "CCR5-∆32 is deleterious in the homozygous state in humans" Xinzhu Wei & Rasmus Nielsen.  Nat Med 2019-06-03;NEWS AND VIEWS "The hidden cost of genetic resistance to HIV-1" Luban J. Nat Med 2019-06-03.

 CRSPRbabiesは、技術的にも倫理的にも、そしてHIV予防の戦略的にも、不適切であったことが指摘されてきたが(*1)、今回、CCR5の∆32変異を狙った戦略が未熟であったことが改めて示された。

 これまでに、CCR5のホモ型∆32変異は、インフレエンザ感染による死亡率が高く、また、感染症に罹患する率が4倍になるという報告がなされていたが、解析したコホートが小規模であった。UC Berkeley/ U. Copenhagenの研究チームはUK  Biobank (*2)に由来する409,693人のジェノタイピングと臨床記録 (死亡届)のデータをもとに、CCR5イタ-∆32がヒトの適応度に及ぼす効果を解析した。
  • ∆32の頻度は0.1159と稀であるが、UK Biobankにはホモ型∆32の個人数千人のデータが登録されていたことから、∆32/∆32、∆32/+ および+/+のジェノタイプの適応度を比較解析することが可能になった。
  • 平均年齢56.5歳のコホートにおける3種類のジェノタイプについて76歳までの生存率を計算し、それぞれ、0.8351、0.8654および0.8638を得た。すなわち、∆32/∆32は76歳までに死亡する率が~21%高いという結果となった。また、サンプルを取得した時点で∆32/∆32個人にはハーディー・ワインベルグ平衡からのずれが見られた。
  • CRISPR遺伝子治療にあたっては、遺伝子変異導入が適応度を高めるとしても、有害作用が誘導されるリスクを十二分に検証する必要がある。
 参考crisp_bio記事
  • (*1) 2019-02-27 賀建奎らによるヒト胚でのCCR5遺伝子編集の意味を改めて考える (2)
  • (*2) 2019-01-08 英国500,000人のバイオデータ公開のインパクト
2. [展望] 生殖細胞系列遺伝子療法の進め方
[出典] PERSPECTIVE "Principles of and strategies for germline gene therapy" Wolf DP, Mitalipov PA, Mitalipov SM. Nat Med 2019-06-03;"Germline gene therapy pioneer, teenage son make case for safe treatment" OHSU News 2019-06-03

 CRISPRbabiesの出現によって、精子、卵子あるいは着床前胚の遺伝子編集 (生殖細胞系列の遺伝子編集)臨床研究にモラトリウムを求める声が大勢をしめるに至った。オレゴン健康科学大学 (OHSU)のCenter for Embryonic Cell and Gene Therapy所長のShoukhrat Mitalipov (シュークラト・ミタリポフ)**は今回、17歳の息子PaulおよびOHSUの (産婦人科)のDon P. Wolfは今回、10,000種類を超える単一遺伝子変異を病因とし治療法が存在しないあるいはあったとしてもきわめて高価な遺伝病治療の有力な手段であり、また、着床前診断を介した遺伝病対応よりも、体外受精と生殖細胞系列遺伝子編集による遺伝病治療法 (germline gene therapy: GGT)の組み合わせが取るべき道であると主張した。
 OHSU Newsによると高校生でStanford大学進学予定のPaulは、2018年の夏休みにOHSUのMitalipov研で論文の図と参考文献リストの作成、ならびに、用語とテキストを一般人にも分かり易くする役割を担ったとのことである。
 (**) CRISPRメモ_2017/08/03(ヒト胚ゲノム編集心疾患変異修復、マウス胚ゲノム編集)

3. Cas12aのDNA/RNAのcis-およびtrans-切断活性の全体像 - dsDNAへのニック誘導
[出典] "Pervasive off-target and double-stranded DNA nicking by CRISPR-Cas12a" 
Murugan K, Seetharam AS, Severin AJ, Sashital DG. bioRxiv 2019-06-02.

 Cas12a (Cpf1)は真核生物では標的配列のミスマッチに対して寛容ではないとされているが、宿主微生物内でのミスマッチに対する寛容性は判然としていない。Iowa State Universityは今回、配列を一部ランダム化したライブラリーを用意し、Cas12aのヌクレアーゼ活性をin vitroで解析した。

 その結果、New England Biolabsの研究グループの報告***に続いて、Cas12a (As, LbおよびFnの3種類)がdsDNAにニックを入れることを見出し、Cas12aのヌクレアーゼ活性の全体像を描いた (投稿Fig. 6参照):
  1. Cas12a-crRNAは、dsDNAのcrRNAにマッチする配列に結合してdsDNAをcisイタ切断し、crRNAに対するミスマッチ配列の一部にニックを入れる。
  2. 切断されたdsDNAのPAM近位の標的鎖にはCas12aが結合しヌクレアーゼ活性を維持し、一方で切断されたdsDNAのPAM遠位部分はCas12aから遊離する。
  3. 活性なRuvCドメインは、切断されたPAM遠位のdsDNAおよび第1段階でニックが入ったdsDNAを基質として、ニックを入れ、結果的に、ssDNAとssRNAおよびdsDNAを非選択的に切断する。
 (***) New England Biolabs報告関連crisp_bio記事
  • 2019-04-11 Cas12aは標的dsDNA切断時に、ssDNAだけでなくdsDNAとssRNAもトランスに分解する

[出典] COMMENT "Reboot ethics governance in China" Lei R, Zhai X, Zhu W, Qiu R. 
Nature 2019-05-08.

 省察
  • 華中科技大学、北京协和医院、復旦大学ならびに中国社会科学院哲学研究所の生命倫理の研究者が、香港でのゲノムサミットでの'CRISPRbabies'を契機とする中国における自己点検と、今後の中国における科学と倫理のガバナンス (nation's governance)のあり方について投稿した。
  • 近年の中国アカデミアに生じた「アジアさらには世界初」に対する過度な高評価と経済的便益、ならびに規制の不備を背景とした先陣・功名争いを指摘:CRISPR-Cas遺伝子編集と同等の機能があるとしたNgAgo論文発表 、2012年に政府が禁止するまで数百の病院で行われていた幹細胞療法、インフォームド・コンセントを得ないで実施された6~8歳の児童を対象とする遺伝子改変コメ摂取実験、さらには、脳移植*の提案 (*遺体間の頭部移植が中国で行われたと報道されている)。
  • 生命倫理、新技術、さらには人間性 (humanity)に関する教育の欠如
 提言
  • 規制、登録、モニター、情報提供、教育、ならびに偏見解消 (障害者に対する偏見と優生学的発想の排除)についてあるべき姿を提案
  • 米国では、米国公衆衛生局が1932~1972年に行ったタスキギー梅毒実験 が明るみにでたことから医学研究における倫理的規制の議論が巻き起こり1978年のBelmont Report (被験者保護のための倫理原則およびガイドライン)に至った。中国で生命倫理学分野が確立されてからまだ30年である。'CRISPR babies'スキャンダルを契機として、中国は、科学と倫理のガバナンスを根底から見直すべきである。
 中国におけるアグレッシブな研究の動向関連記事

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