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[出典] "Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer" Mahendra C [..] Bondy Denomy J. Nat Microbiol 2020-03-26

 バクテリアとアーケアはCRISPR-Cas獲得免疫システムを備えることで、バクテリオファージ/ウイルスとプラスミドを含む遺伝的パラサイトの侵入に対抗する。一方で、ファージの多くが、この免疫システムを阻害するanti-CRISPR (Acr)タンパク質を備えている。

 Acr遺伝子はこれまで専らファージまたはプロファージのゲノムで発見されてきたが、Joseph Bondy-Denomyらは、ファーミキューテス (Firmicutes)門のバクテリアに内在するプラスミドなどの可動性遺伝因子 (conjugative elements)がacr遺伝子座を帯びていることを、Listeria acrIIA遺伝子をマーカとして発見した。
  • Listeria, Enterococcus, StreptococcusおよびStaphylococcusの各属から4種類のacr遺伝子を発見し、タイプII-A SpyCas9またはSauCas9を阻害することを同定し、acrIIA16–19と命名した。
  • Enterococcus faecalisでは、Enterococcus可動性遺伝因子に由来するAcrsを介してCas9の標的となったプラスミドの接合が亢進されていた。すなわち、Acrsがプラスミド拡散に一役かっていることが示された。
  • 共免疫沈降法により、各Acrタンパク質が、Cas9と複合体を形成することで、Cas9が失活すること同定し、ノーザンブロッティングにより、gRNAの長さ、ローディングまたは安定性に影響を与えることが示唆する結果を得た。
  • また、これらのAcrタンパク質が、バクテリア細胞内と同様に、ヒト細胞においても、広汎なCas9タンパク質を阻害することを同定した [例:SpyCas9, SauCas9, SthCas9, NmeCas9およびCjeCas9]。
 ファージ由来ではないAcrタンパク質に注目した解析から、Acrタンパク質が広汎なCRISPR−Cas9システムを阻害することで遺伝子水平伝播を亢進するモデルを支持する結果が得られた。

責任著者Joseph Bondy Denomyからの関連論文
  • 2020-03-26 緑膿菌におけるアルギニン酸生合成の制御系が、緑膿菌のCRISPR-Cas活性を抑制する
  • 2020-03-22 [レビュー] 抗-CRISPRタンパク質 (Acrタンパク質)の応用: CRISPR-Casに対する天然のブレーキ
  • 2020-01-25 機械学習によりゲノム配列から16,929種類のAcrsを推定し、2,500種類の新奇Acrファミリーを提案
  • 2019-12-11 ジャンボファージは殻に籠もってCRISPR-Casシステムと制限酵素から身を守る (2報)
  • 2019-10-02 リステリアファージが抗CRISPRタンパク質 (Acrs)を2〜3種類備えている理由
  • 2018-09-08 抗CRISPR (Acr)タンパク質:Cas12a阻害タンパク質を含む12種類を発見
  • 2017-06-12 CRISPRオフスイッチ:CRISPR vs 抗-CRISPR

1. CRISPR/dCas9によるエピゲノム編集ツールを利用して、Fgf21遺伝子プロモーターのDNA脱メチル化を実現
[出典] "Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing" Hanzawa N, Hashimoto K [..] Ogawa Y. Sci Rep 2020-03-20
  • 東京医科歯科大学の橋本貢士と小川佳宏らは先行研究で、マウス乳仔期の肝臓において、線維芽細胞増殖因子21 (FGF12)が、肝臓での脂質代謝を制御する核内受容体PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor α)依存で脱メチル化を受けること、および、リガンド結合によるPPARαの活性化を介して、DNA脱メチル化ひいてはFGF12の発現が亢進することを報告していた。
  • 研究グループが利用したエピゲノム編集ツールは、CRISPRaの一種であるSunTagシステムに準拠して [*]、dCas9に、22 aaの長さのリンカーを介して、5連のGCN4 -  単鎖可変領域フラグメント (scFv) - 脱メチル化酵素TET1の触媒ドメイン (TET1CD)を結合した人工因子である [Figure 1 引用下図 a 参照]。DNA demethylation 2020-03-28 21.44.07
  • Fgf21のプロモーター領域を標的とするこの人工因子によって、マウス肝癌細胞株Hepa1-6とPPARα欠失マウスにおいて、それぞれ、PPARαの合成リガンド投与と断食をキューとするFgf21のDNAメチル化低減を介して、Fgf21の発現が亢進することを示した。
  •  [*] CRISPR関連文献メモ_2016/09/03 #2 [論文] 脱メチル化によって標的遺伝子を特異的にin vivo 活性化するCRISPR/Cas9ツールボックスを開発
2. Cdk5遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9と抗癌剤を共に、弱酸性pH応答性ナノ粒子でデリバリすることで、腫瘍微小環境を'cold'から'hot'へ改変
[出典] "Reshaping tumor immune microenvironment through acidity-responsive nanoparticles featured with CRISPR/Cas9-mediated PD-L1 attenuation and chemotherapeutics-induced immunogenic cell death" Tu K [..] Zhang Z. ACS Appl Mater Interfaces 2020-03-20
  • 表題のデリバリー法により、CRISPR/Cas9によるCdk5 (サイクリン依存性タンパク質キナーゼ5)のノックアウトを介したPD-L1発現抑制に、パクリタキセルによる免疫応答を引き起こす細胞死 (immunogenic cell death: ICD)の誘導、Tregの抑制、腫瘍随伴マクロファージの再極性化、および抗腫瘍免疫応答の亢進の効果が加わり、腫瘍成長が効果的に抑制され、全生存期間が伸びるに至った。
3. ヌクレオソーム枯渇‘mini’U6 Pol IIIプロモーターを介して多重sgRNAsによるCRISPR/Cas9遺伝子編集を実現
[出典] "'Mini'U6 Pol III promoter exhibits nucleosome redundancy and supports multiplexed coupling of CRISPR/Cas9 effects" Preece R, Georgiadis C, Gkazi SA et al. Gene Ther 2020-03-20
  • RNAポリメラーゼ III (Pol III)は、短鎖ノンコーディングRNAsを発現し、CRISPR sgRNAの発現にも利用され、Pol IIIのH1とU6を組み込んだベクターはゲノム編集療法に利用されている。英国の研究グループは今回、
  • レンチウイルスのLTR領域に表題U6プロモーターを埋め込むことで、高レベルの転写活性を実現した。さらに、‘mini’H1とU6の二重プロモーターを介した二重sgRNAs転写によりTCRとHLA分子の同時破壊を実現し、ユニバーサルCAR T細胞の効率的作出の可能性を示した。
4. [レビュー] 抗-CRISPRタンパク質の分子機構は多彩である: 氷山の一角?
[出典] "Diversity of molecular mechanisms used by anti-CRISPR proteins: the tip of an iceberg? " Hardouin P,  Goulet A. Biochem Soc Trans 2020-03-20
  • CRISPR-Cas獲得免疫機構の各ステップに干渉する分子機構に注目し、オルソステリックな阻害、アロステリックな阻害、CRISPR-Casコンポーネントを非可逆的に改変する酵素活性などの多彩な分子機構をレビュー
5. CRISPR関連研究の最新動向ハイライト - 主として2017-2019年に刊行された論文の簡潔な紹介
[出典] "Recent advances in CRISPR research" Chen B [..] Li W. Protein & Cell 2020-03-21
  • SpCas9変異体作出およびホモログの発見; 塩基エディティング; dCasイメージング; 植物育種への応用; 動物の育種と疾患モデル動物の作出; Ex vivo/in vivo遺伝子編集による療法研究
6. ディスレクシア, 自閉症, アルツハイマー病に関連するDip2aホモ型ノックアウトmESC株IBMSe001-A-1を樹立
[出典] "Generation of Dip2a Homozygous Knockout Murine ES Cell Line IBMSe001-A-1 via CRISPR/Cas9 Technology" Yao M [..] Wu C, Zheng Y. Stem Cell Res 2020-03-19

7.  殺虫活性を帯びた3種類のBt毒素に対する農業害虫シロイチモジヨトウの候補受容体5種類を、CRISPR KOスクリーンで評価
[出典] "Evaluation of five candidate receptors for three Bt toxins in the beet armyworm using CRISPR-mediated gene knockouts" Huang J et al. Insect Biochem Mol 2020-03-19
  • 3種類のBt毒素と5種類の受容体との相互関係明らかに: 毒素Cry1AcとCry1Faに対して受容体のABCC2が主にCad1が従に応答する; ABCC2はCry1aにも応答する。

1. [レビュー]抗-CRISPRタンパク質 (Acrタンパク質)の応用: CRISPR-Casに対する天然のブレーキ
[出典] "Anti-CRISPR protein applications: natural brakes for CRISPR-Cas technologies" Marino ND, Csörgő B [..]  Bondy-Denomy J. Nat Methods 2020-03-16.
  • UCSFを主とする研究グループによるレビュー
  • 基礎: これまでに, 機序も構造も様々で配列も相互に異なる多彩なAcrタンパク質が45種類 (CRISPR-Casのクラス1に対して21種類, クラス2に対して2種類)発見されている:表1 に, 名称, 阻害するCRISPRサブタイプ, 阻害対象とするCasの機能などの一覧;Fig. 1にCRISR-Casの免疫応答とAcrによる阻害の機序模式図。
  • 応用: 原核生物ならびに真核生物におけるAcrによるCRISPR-Casシステムの翻訳後調節への応用、Arcタンパク質の活性制御、Arcによる遺伝子ドライブ制御、その他に、Cas9タンパク質の検出 (CRISPRメモ_2019/06/05 #3) や、Cas9タンパク質の一時的発現をもたらすヘルパー依存性アデノウイルス・システム (CRISPRメモ_2019/04/21-2 #6) など。
2. [レビュー] 抗-CRISPR (Acrs): CRISPR-Casシステムを阻害するタンパク質
[出典] "Anti-CRISPRs: Protein Inhibitors of CRISPR-Cas Systems" Davidson AR, Lu WT, Stanley SY, Wang J, Mejdani M, Trost CN, Hicks BT, Lee J, Sontheimer EJ. Annu Rev Biochem 2020-03-18 (Expected final version 2020-06-22)
  • University of TorontoとUMMSの研究グループによるレビュー
  • 論文91編を引用し24ページにわたり、Acrsの発見、CRISPR-Casを阻害する機序(概観、タイプIに対するAcrsの機序、タイプIIに対するAcrsの機序、タイプVに対するAcrsの機序、まとめ)、AcrsおよびAcrs関連タンパク質 (Acaタンパク質)のin vivoイタ機能、AcrsとCRISPR-Casとの間の軍拡競争、ならびにAcrsの応用をレビューし、将来を展望した。

5. [特許公開 2件] 
(1) Cas12aによるssDNA/dsDNAの高感度検出法
[出典] US20200032325A1 Specific detection of deoxyribonucleic acid sequences using novel CRISPR enzyme-mediated detection strategies (公開日 2020-01-30). 
  • 発明者 Baughman TA, Madan D, Nalefski E, Le Ny AM.
  • 権利者 TOKITAE LLC
(2) Cas13aによる超高感度RNA検出法
[出典] US20200032324A1 Specific detection of ribonucleic acid sequences using novel CRISPR enzyme-mediated detection strategies. (公開日 2020/01/30)
  • 発明者 Baughman TA, Cate J, Doudna J, Knott GJ, Madan D, Nalefski E, Le Ny AM, Thornton B.
  • 権利者 TOKITAE LLC, U Calfornia
[関連crisp_bio記事] crisp_bio: CRISPR-Cas12コレクション; crisp_bio: CRISPR-Cas13コレクション

6. [ミニレビュー] CRISPR/Cas9システムによる放射線の遺伝毒性のモデリングと解明
[出典] Deciphering and Simulating Models of Radiation Genotoxicity with CRISPR/Cas9 Systems. Vukmirovic D, Seymour C, Mothersill C. Mutat Res/Reviews in Mutation Research. 2020-02-03
  • CRISPR/Cas9を介した二本鎖切断に対する細胞応答を利用することで、放射線の遺伝毒性のモデリングが可能である。種々のストレス因子の作用や放射線の線量効果も、それぞれ補助的なドメインのCas9への付加や、anti-CRISPRタンパク質の利用によって、モデリング可能である。
7. ゲノムワイドCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーン (GeCKO)により、マウスES細胞の多能性状態からの脱出に必須の遺伝子を同定
[出典] Screening Genes Promoting Exit from Naive Pluripotency Based on Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout. Yang B [..] Chen R, Zhao M, Zhu P. Stem Cells Int 2020-02-03
  • 広州市の研究機関を主とする研究グループは、GeCKOv2ライブラリによるGeCKOスクリーニングを介して、多能性状態からの脱出に必須な遺伝子4種類 (TCF7l1, p53, Jarid2, およびFbxw7)を同定し、この手法の有用性を示した。
8. CRISPR/Cas9により成長ホルモン放出ホルモン (GHRH)をノックアウトしたマウスの生理学的特徴と代謝機能
[出典] Physiological and Metabolic Features of Mice with CRISPR/Cas9-Mediated Loss-of-Function in Growth Hormone-Releasing Hormone. Icyuz M, Fitch MP [..] Sun LY. bioRxiv 2020-02-07 
  • University of Alabama at Birminghamの研究グループは先行研究で、マウスES細胞における遺伝子ターゲッティングで作出した成長ホルモン放出ホルモン (GHRH)欠損モデルマウスの寿命が延び代謝ホメオスターシスが向上することを見出していたところ、今回、CRISPR/Cas9による GHRH-/- マウスが、先行研究のモデルマウスと同様な特徴を帯び、成長ホルモン欠乏の長寿効果を見るモデル足り得ることを示した。
  • 野生型同腹仔に対する GHRH-/-マウスの特徴:耐糖能は正常なまま、体重が減少しインスリン感受性が亢進; 骨密度, 骨塩量および除脂肪量が劇的に低減し、体脂肪量が顕著に増加; エネルギー消費量は低く、呼吸交換比 (respiratory exchange ratio, RER)と呼吸交換比が明期に限り減少。

[出典] Coupling Cas9 to artificial inhibitory domains enhances CRISPR-Cas9 target specificity. Aschenbrenner S, Kallenberger SM [..] Eils R, Niopek D. Sci Adv 2020-02-05

 抗CRISPR (Acr)タンパク質を改変しSpCas9の活性を光制御するCASANOVA法 [1]を開発したUniversity of HeidelberとUniversity Hospital Heidelbergなどの研究グループによる報告
  • はじめに、Cas9−sgRNAのDNA切断に至る過程の数理モデルを構築し、Cas9-sgRNA複合体の量を微調整することで、sgRNAに結合親和性が高いオンターゲットと低いオフターゲットを切り分け可能であるという仮説に至った。
  • この仮説を、Cas9と抗-CRISPRタンパク質AcrIIA4、および、高頻度なオフターゲットサイト2ヶ所を伴うことが知られているAAVS1を標的とするsgRNAをHEK293細胞などで共発現させて、Cas9-sgRANに対するAcrIIA4の比率による切断活性を測る実験により、実証した。
  • 次に、AcrIIA4の量の調節に替えて、Cas9の活性を阻害するAcrIIA4の活性を変異導入によって抑制し [1, 2]、Cas9のC末端に40残基のグリシン・セリン・リンカーを介して連結 (以下、Cas9-Acr)した上でデリバリーすることで、より安定したCas9活性の微調整を実現した。
  • 10種類のCas9-Acrから3種類の変異体 (Ins. 5; N39A; D14A/G38A)からなる3種類のCas9-Acrを選択し、AAVS1に加えて、EMX1とHEKを標的としてCas9活性の微調整とオンターゲット/オフターゲット切換を評価した (Fig. 2引用下図参照: 図の中のAIDは、自己抑制ドメイン/AutoInhibitory Domainに由来し、AcrIIA4変異体がその実体)。Cas-Acr
  • 研究グループは、野生型Cas9の他に、3種類の高精度版Cas9 (Sniper-Cas9 [3]; xCas9[4]; HypaCas9 [5])についてもCas9-Acrシステムを評価し、高精度版Cas9のオリジナル版もAcr連結版も、そのふるまいが標的遺伝子座に大きく左右されることを見出した。
  • さらに、Cas9、Cas9−Acr野生型および3種類のCas9-Acr変異型の一時的発現に由来するタイムラプスデータに基づいて数理モデルを改訂し、標的遺伝子座の特徴とCas9の活性の時間積分に依存するCas9−Acrの定量的モデルを構築した (定量的モデルによって、Cas-Acr変異型により、オフターゲット編集を最小限にオンターゲット編集を最大限にする'スイートスポット'を予測可能: 'Fig. 4 -d引用下図参照)。Fig. 4
 [引用crisp_bio記事]
  1. 2018-11-03 CASANOVA:抗CRISPR (Acr)タンパク質を改変しSpCas9の活性を光制御する
  2. CRISPRメモ_2018/03/09 [第1項] SpCas9活性と遺伝子ドライブを抗-CRISPRタンパク質 (AcrIIA2; AcrIIA4)によって調節する:酵母での実証
  3. 2018-08-08 [第2項] ランダム変異導入から高精度・高活性なCas9変異体を開発 (2件)
  4. 2018-03-02 xCas9:PAMの拡張とオフターゲット抑制を両立
  5. 2019-10-11 Cas9の高精度版HypaCas9により、マウス受精卵におけるアレル特異的遺伝子改変を実現

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