[レビュー] クラス２CRISPR-Casシステムの分子機構と性能向上 : crisp

出典

[Perspective] Genome editing by natural and engineered CRISPR-associated nucleases. Wu WY, Lebbink JHG, Kanaar R, Geijsen N, van der Oost J. Nat Chem Biol 2018 June 18.
今回の責任著者であるJohn van der OostはFeng ZhangやEugene V. Kooninらと共著でScience誌2016年8月5日号にてレビュー「CRISPR/Casシステムの多様な進化のルーツと機構」を発表していたが、今回は、クラス１とクラス２に大別されるCRISPR Casシステムの中で、クラス２の分子機構と性能向上の試みをレビュー
[関連資料] クラス２ CRISPR-Casシステム関連レビュー："Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems" Shmakov S [..] Zhang F, Koonin EV. Nat Rev Microbiol. 2017 Mar;15(3):169-182. Published online 2017 Jan 23.

クラス２ CRISPRヌクレアーゼの標的切断の分子機構

クラス１とクラス２の対比；クラス２タイプⅡのCas9とクラス２タイプVのCas12a/Cpf1およびCas12b/C2c1について分子機構を比較対照し (サイズ、トランス活性化RNAの必要性、PAM配列、シード配列の長さ、二本鎖DNA切断の特徴およびスペーサの長さの対照表あり)、クラス２タイプⅥのRNAガイドRNA切断活性を帯びたCas13a/C2c2とCas13b/C2c6にも言及

クラス２CRISPRヌクレアーゼのオフターゲット抑制 - sgRNAとCas9の改変またはタイプVの利用

sgRNA活性の長さと配列を構成する塩基の調節；eSpCas9, Cas9-HF1, HypaCas9, デュアルnCas9, dCas9-FokI；AsCas12aとLbCas12aではほとんどオフターゲット編集が見られなず、Cas12bもin vitroではオフターゲット編集検出されず

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CRISPRメモ_2018/04/18 - 2. CRISPR/Cas9による二本鎖DNA切断修復にあたり、誤りが多いNHEJに対して精密な編集を可能とするHDRの比率を高める法

Cas9-sgRNA複合体RNPのin vivo活性調節によるオフターゲット抑制

[不活性状態から活性化] agRNA (aptazyme)を埋め込んだsgRNA)をsgRNAに融合し、aptazymeの自己開裂を誘導する低分子でsgRNAの活性を調節；sgRNAまたはラパマイシンにより分割しておいたCas9 (split Cas9)を二量体化；インテイン結合やリジンのケージ化で不活性化したCas9をそれぞれインテイン開裂低分子と紫外光照射で活性化；菌類由来の光受容体VVD (Vivid)から作出されたMagnetsドメイン (pMagとnMag)を二分割したCas9のN末端側とC末端側に結合しておくことで、青色光によりCas9を一体化ひいては活性化 (活性調節可逆的）
[活性状態から不活性化] 編集標的遺伝子用sgRNAとcas遺伝子を標的とするsgRNAの併用；抗CRISPRタンパク質のデリバリー；Cas9にエストロゲン受容体αを組込み、リガンドでCas9活性をアロステリックに調節 (arCas9)；Cas9にエストロゲン受容体ERT2を融合し、リガンドでCas9を細胞質から核へ移行 (iCas9)；Cas9にジヒドロ葉酸レダクターゼ (DHFR)を融合しトリメトプリムによりCas9分解 (Degron Cas9)；Magnetsドメインと青色光によるCas9の二量体化 (活性調節可逆的）

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ゲノム編集の多重化

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ゲノム編集システムのデリバリー

臨床応用には、高い編集効率に加えて、細胞毒性を最小限にとどめかつ遺伝子改変完了後速やかに消滅するデリバリー法が必要であるが、まだ実現していない。
AAV、エレクトロポレーション、ポリマー/脂質/DNA/金のいずれかのナノ粒子、iTOP (induced transduction by osmocytosis and propanebetaine)の各手法について、デリバリーの適用範囲 (in vitro/ex vivo/in vivo)、デリバー対象 (ssDNA/DNA/RNA/RNP)、存在期間 (数時間〜数年)および長所短所の一覧

CRISPRに誘導されるDNA切断の修復機構

非相同末端結合 (NHEJ)：典型的NHEJ (C-NHEJ)、DNA末端のマイクロホモロジーに依存する代替的NHEJ (Alt-EJ)
ドナーDNAの利用：相同アームを融合したドナーDNAを利用する相同組換え修復；ssODNを利用する一本鎖アニーリング (single-strand annealing: SSA)または合成依存的単鎖対合(synthesis dependent single-strand annealing model: SDSA)
CRIS-PITCh法；HITI法

１塩基編集