[出典] "Efficient single-copy HDR by 5' modified long dsDNA donors" Gutierrez-Triana JA, Thumberger T, Tavhelidse T [..] Wittbrodt J. bioRxiv 2018-06-22
- CRISPR/Cas9は、DSBのNHEJ修復機構を介してゲノム上の標的部位への効率的変異誘発を可能にしたが、遺伝子の修復、置換あるいはタギングなどのゲノム編集には、細胞周期のS/G2期後半で活性が上がって来るDSB修復機構HDRを介した内在DNA断片の精密な編集が必須である。これまで、NHEJに対してHDRを亢進するために、酵素によるNHEJの抑制、Cas9の改変によるHDRの亢進など様々な手法が提案されてきた。
- HDRによるゲノム編集では、CRISPR/Cas9に加えて、標的の遺伝子座に相同な隣接領域を帯びた修復用DNAドナーを使用することで、特定の変異やDNA配列を挿入する。HDRと並存しているNHEJは高活性であり、CRISPR/Cas9を介した標的DNA部位の切断を再結合するとともに、直鎖状dsDNAドナーテンプレートの多量体化をもたらすことから、シングルコピーのドナーテンプレートに基づくHDRは極めて稀になる。しかし、この多量化の問題への取り組みはなされていなかった。
- ハイデルベルグ大学の研究チームは今回メダカにおいて、内在するDNA修復機構に干渉することなく、修復用の長いdsDNAの双方の5'末端をバルキーな分子で修飾することにより、ドナーをNHEJと多量体化から保護可能なことを示した。
- メダカの一細胞期胚において、ビオチンとSpC3で修飾したドナーは6時間後も単量体に止まった一方で、修飾しなかったドナーは２時間後にはすでに多量体化することを、見出した。続いて、ビオチン修飾ドナーを使用することで、in vivoでGFP配列1コピーのノックインを60%の効率で達成した。
参考資料：
- crisp_bio 2018-06-21：[レビュー] クラス２CRISPR-Casシステムの分子機構と性能向上 - 「CRISPRに誘導されるDNA切断の修復機構」
- CRISPRメモ_2018/06/20- 6. CRISPR/Cas9とオリゴDNAによるゼブラフィッシュへの点変異ノックインを最適化
- CRISPRメモ_2018/06/16 - 4. 高効率・高精度なHDRノックイン：Cas9の標的部位切断と同時にドナーDNAカセット両端切断
- CRISPRメモ_2018/06/11-2 - 1. DMSOがゲノム編集を効率化
- CRISPRメモ_2018/06/07- 1. DSB修復パスウエイを標的とする低分子セット“CRISPY mix”を調合、iPSCにおいて、HDRを介したゲノム編集を精密化する
- CRISPRメモ_2018/06/03-1 - 2. ヒト細胞のゲム編集におけるCRISPR-Casシステム選択ガイド
- CRISPRメモ_2018/06/01- 1. DNA修復テンプレートをCas9に共有結合させておくと、HDRが亢進する
- CRISPRメモ_2018/05/30-3 - 2. [プロトコル]蛍光タンパク質のホモ接合ノックイン細胞の生成と判定
- CRISPRメモ_2018/05/22 - 2. モデル生物酵母における高速機能ゲノミクスの基盤構築 (guide+donor strategy)
- CRISPRメモ_2018/05/08-2 - 7. Saccharomyces cerevisiaをゲノムスケール１塩基精度で改変可能とする'CHAnGE'
- CRISPRメモ_2018/05/05- 2. コンディナルノックアウトマウスの１段階作出法’CLICK'
- CRISPRメモ_2018/05/03 - 1. CRISPR/Cas9 HDRを介して哺乳類細胞での抗体ハイスループット・スクリーニングを実現
- CRISPRメモ_2018/04/18 - 2. CRISPR/Cas9による二本鎖DNA切断修復にあたり、誤りが多いNHEJに対して精密な編集を可能とするHDRの比率を高める法
- crisp_bio 2018-04-15：細胞周期を制御することで造血幹細胞・前駆細胞における精密遺伝子修復を亢進する
- CRISPRメモ_2018/04/13-1 - 3. 重なり合う多重sgRNAsがCRISPR/Cas9ノックインの効率を改善する
- CRISPRメモ_2018/03/21 - 2. Cas9にCtIPを融合することで、相同組換え修復 (HDR)を介した外来遺伝子導入を亢進
- CRISPRメモ_2018/01/21 - 2. Cas9ゲノム編集における相同組換え修復（HDR）効率を改善
- crisp_bio 2017-05-06：非相同末端結合（NHEJ）によって、in vivo で非分裂細胞に外来遺伝子をノックイン
- CRISPR関連文献メモ_2016/11/20 2. [論文] CRISPR/Cas9ゲノム編集において相同組換え修復（HDR）の効率を高める新たな手法
- CRISPR関連文献メモ_2016/11/20 - 1. [論文] 非相同末端結合（NHEJ）を介した甲殻類へのノックイン
コメント