1. CRISPEY：超並列精密ゲノム編集による機能ゲノミクス
[出典] "Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing" Sharon E,  Chen  SAA, Khosla NM, Smith JD, Pritchard JK, Fraser HB. Cell. 2018 Sep 20.
  • シーケンシング技術の進歩によりゲノム変異を同定することは容易になったが、病因変異など遺伝変異と表現変異の因果関係を同定することは、QTLやGWASによる解析の分解能が低いこともあり、未だ困難である。
  • スタンフォード大学の研究チームは今回、CRISPR/Cas9を介した相同組換えに基づきながらも高効率、高精度な大規模並列ゲノム編集を実現するCRISPEY (Cas9 Retron precISe Parallel Editing via homologY)を開発し、酵母の機能ゲノミクスでその有用性を実証した。
  • CRISPEYの鍵を握るレトロン (retorn)は、バクテリアで発見された逆転写酵素(RT)とmulticopy single-stranded DNA (msDNA)と呼ばれる独特のssDNA/RNAハイブリッドをコードしているDNAエレメントである (下図：レトロン・エレメントから生成されるmsDNAの前駆体であるretron msr RNA)。Retron msr RNA
  • 研究チームは、E. coli Ec86レトロンのバクテリアレトロン配列を100-ntの長さの相同組換えドナーと相同アームの配列に置換し、3'末端にsgRNAを結合することで、核内で相同組換え用ドナーとなるssDNAsを大量に生成するCRIPEYを実現した (Retron-guide RNAとdonor-guide RNAの構造について原論文Figure 1-A参照)。
  • 研究チームは、２種類の酵母株 (よく利用されている実験室株BYとブドウ園からの分離株RM)を対象として、16,006種類のSNPsと短いindelsを標的とする32,000組のsgRNA/ドナーのRTコンストラクトのプール型ライブラリーを介してRMアレルをそれぞれBY株に導入し、2%のグルコースを含む最小培地に対する適応度を判定した。
  • その結果、適応度に有意な違いが見られる572種類の遺伝変異を同定した。これらの遺伝変異は、プロモーター (特に、転写因子結合部位)にエンリッチされており、タンパク質コーディング領域（アミノ酸配列）に影響を与える遺伝変異は19.2%にすぎなかった。また、互いに50-bpの範囲に位置する遺伝変異が、適応度を同じ方向へ変化させることも見出した。
2. [プロトコル] 抗体を安定発現するハイブリドーマを作出するプラットフォームをCRISPR-Cas9技術で構築
[出典] Protocol "Genome Engineering of Hybridomas to Generate Stable Cell Lines for Antibody Expression" Parola C, Mason DM, Zingg A, Neumeier D, Reddy ST. In: Hacker D. (eds) Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells. Methods in Molecular Biology. 2018 Sep 22.
  • 関連論文："Immunogenomic engineering of a plug-and-(dis)play hybridoma platform" Pogson M, Parola C, Kelton WJ, Heuberger P, Reddy ST. Nat Commun. 2016 Aug 17.
  • Plug-and-(dis)play (PnP) バイブリドーマプラットフォーム；免疫グロブリン遺伝子座を標的とするCRISPR-Cas9技術により、HDRを介して内在VHを蛍光レポータータンパク質 (mRuby)で置換し、続いて、再編成されたVLを削除（関連論文Figure1引用下図上参照）
Hybridoma
  • CRISPR技術により、HDRを介してmRubyを合成抗体遺伝子 (sAb; VL+Cκ+自己開裂２Aペプチド+
    VH)で置換したPnP細胞は細胞表面で全長IgKとIgHを発現 (関連論文 Figure /2から引用上図下参照)
  • FACSを利用してsAbを発現する細胞を選別し、その培養上清から目的とする抗体を採取
3. 多系統萎縮症 (MSA)患者由来iPSCから誘導したニューロンにおけるコエンザイムQ10の作用
[出典] "The pathogenesis linked to coenzyme Q10 insufficiency in iPSC-derived neurons from patients with multiple-system atrophy" Nakamoto FK, Okamoto S, Mitsui J, Sone T, Ishikawa M, Yamamoto Y, Kanegae Y, Nakatake Y, Imaizumi K, Ishiura H, Tsuji S, Okano H. Sci Rep. 2018 Sep 21.
  • 慶応大、東大、慈恵医大の研究チームは、先行研究で、Q10の生合成経路の必須酵素COQ2の機能喪失変異がMSA (Multiple-system atrophy)と相関することを見出していたが、今回、患者由来の神経細胞の細胞死亢進を、Q10によって抑制可能なことを見出した。
  • 研究チームは、COQ2複合ヘテロ接合体変異を帯びたMSA患者由来のiPS細胞から誘導した神経細胞において、ミトコンドリア呼吸と抗酸化システムの機能不全を見出した。
  • さらに、COQ2遺伝子変異をCRISPR/Cas9を介して修復することで、機能回復が可能なことを示した。
4. EGFRを阻害することで抗PD-1免疫療法が強化される
[出典] "A high-throughput immune-oncology screen identifies EGFR inhibitors as potent enhancers of antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte tumor cell killing" Lizotte PH [..] Janne PA. Cancer Immunol Res. 2018 Sep 21.
  • 卵白アルブミン (OVA)を発現させたマウス卵巣癌細胞株ID8とCD8陽性T細胞を共培養し、T細胞の細胞障害性に及ぼす低分子をスクリーニングし、EGFR阻害剤 (エロチニブ)がT細胞の細胞障害性を最も亢進することを同定
  • また、Cas9を恒常的に発現させたID8細胞を対象とするプール型CRISPRスクリーニングからも、EGFRを標的とするsgRNAが、T細胞に対する感受性を高めることを同定