[出典]News & Views "Designing efficient translation" Gorochowski TE, Ellis T. Nat Bioetchnol. 2018 Oct 11.；論文 "Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli" Cambray G, Guimaraes JC, Arkin AP. Nat Biotechnol. 2018 Nov;36(10):1005-1015. Online 2018-09-24.
要約
- 冗長な遺伝暗号を介して、特定のタンパク質をコードするDNA配列は多数存在するが、大腸菌におけるタンパク質合成に最適なDNA配列は予測することは困難であった。U. Montpellier, Lawrence Berkeley National LaboratoryならびにUC Berkeleyの研究チームは今回、ハイスループット実験を介して、開始コドンに近いRNA二次構造における複雑な相互作用が大腸菌におけるタンパク質合成の効率を左右する要因であることを見出した。
背景
- タンパク質工学の基本技術の一つが、宿主細胞の成長を損なうことなくタンパク質の合成量を最大化する技術である。DNA合成のコストが低減されるにつれて、同義置換の関係にある配列の大規模ライブラリーを利用し、様々なプロモーターとリボソーム結合サイトを組み合わせて、大腸菌において、転写と翻訳に影響を与えるコドンと配列の解析が進められてきた。また、リボソームプロファイリング (ribosome profiling)を含むシーケンシングにより、アミノ酸の物性や転写物の二次構造が転写開始と伸長の動態に与える影響が解析されてきた。
- しかし、ほとんどの場合、合成が容易なランダム化配列を実験対象にしていたことから、配列空間における探索対象に偏りがあり、また、長い相補的配列を欠くことからmRNAの顕著な二次構造が形成されないといった問題を伴っていた。加えて、例えばコドンの改変がATの局所量と転写の２次構造を改変するなど、複雑に連関する要素を体系的に制御することが困難であった。
実験
- DNA/アミノ酸鎖の特徴量として、AT含量、コドンの特徴量３項目、ペプチドの疎水性、mRNAの全域にわたる二次構造３項目の計８要素について各要素のレベルも含む全ての組み合わせ1,458種類を対象とする解析を可能とする完全実施要因計画 (full factorial design)に基づいて、96-bpの長さの合成DNA244,000種類を合成しGFPでラベルし、大腸菌でのタンパク質発現実験を行なった。
- その上で、各配列の表現型として、転写物の量と減衰、ポリソーム (ポリリボソーム)プロファイルpolysome profilingタンパク質生産量と細胞成長速を測定した (News & Views Figure 1 参照) 。
- 配列の特徴量と表現型のANOVA (分散分析）と回帰分析の結果、mRNAの二次構造およびその転写物との相互作用が表現型にもっとの大きな影響を与えることを見出した。
- これまでは、コドンの選択が、大腸菌におけるタンパク質合成の最適化を左右すると考えられていたが、RNA二次構造に比べると、コドン、DNA配列のAT含量あるいはアミノ酸の物性・組成がタンパク質合成の効率に与える影響は小さい。
- コドンの組成は、244,000DNAに依存するタンパク質合成の変動の0.05%しか説明することができない。転写開始の構造的阻害が軽減される場合に限って、タンパク質における重みを26.2%以上までに増す。
- 研究チームは今回の結果に基づき、大腸菌におけるタンパク質合成の最適から最も非効率まで６種類のシナリオを描き出した。
- 実験計画法により、予め選択した要素について、網羅的に因果関係を解析することができるが、想定外の要素の影響を発見することは困難である。今回の解析においても、タンパク質合成の変動の半分程度は説明しきれていない。
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