PAMを網羅的に同定する実験技術と、多様なPAMの配列と活性を容易に一覧・比較可能とするツールを開発 : crisp

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科学分野の比較的新しい論文と記事を記録しておくサイト：主に、CRISPR生物学・技術開発・応用 (ゲノム編集, エピゲノム編集, 遺伝子治療, 分子診断/代謝工学, 合成生物学/進化, がん, 免疫, 老化, 育種 - 結果的に生物が関わる全分野) の観点から選択し、時折、タンパク質工学、情報資源・生物資源、新型コロナウイルスの起源・ワクチン・後遺症、機械学習・AIや研究公正からも選択

（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 20160405-1）CRISPR関連文献メモ_2016/04/05

Corresponding authors: Rodolphe Barrangou; Chase L. Beisel (North Carolina State U.)
In vivo でPAMを網羅的にスクリーニングするシステム“PAM-SCANR (PAM screen achieved by NOT-gate repression)”と、同定した各PAMの配列と活性を一覧可能にする対話型可視化システム“PAM-wheel”を開発 [注：1分30秒の解説ビデオYouTube参照]．
PAM-SCANRは、[PAM候補]-[lacI プロモーター]-[LacIに抑制されるlacZ プロモーター]-[GFP] のコンストラクトをベースとしている。
CasヌクレアーゼがPAM候補に結合すると、lacI が阻害され、GFPが発現する。GFPが発現した細胞を回収し、ディープシーケンシグ解析。LacIレプレッサーの活性をイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG) で調節することで、活性が低いPAMsの同定も可能に。
PAM-wheel：PAM配列とエンリッチメント・スコアをKrona plot法で可視化（PAM配列の塩基を、プロトスペーサーから遠ざかっていく順に、wheelの中心から軸方向に放射状に並べる（SpCas9の場合は例えばNGGNの４文字）；エンリッチメント・スコアが高いほど占める扇型の面積が広くなる）
Bacillus halodurans I-C (Cascade), Escherichia coli I-E (Cascade), Streptococcus thermophilus II-A CRISPR1 (Cas9), ならびに Francisella novicida V-A (Cpf1) のPAMを網羅的に同定し評価．カノニカルなPAMを確認するとともに、多様性も見出した。