[出典] "Real-time measurement of protein–protein interactions at single-molecule resolution using a biological nanopore" Thakur AK, Movileanu L (Syracuse University). Nat Biotechnol 2018-12-10.
背景
- PPIsの解析法としてこれまで、一分子蛍光顕微鏡法、反射型干渉分光法 (Pall ForteBio社のBio-Layer Interferometry法)、等温滴定型熱測定法、表面プラズモン共鳴法など、多くの手法が開発されてきたが、一長一短である。シラキュース大学の研究チームは今回、リアルタイムかつハイスループットで分子集団の平均像ではなく一分子単位のPPI解析を可能とするバイオ・ナノポアに基づくタンパク質センサーを開発した。
センサーの構造
- センサーは、バイオ・ナノポアの本体にあたる単量体βバレル構造のスキャフォールドと、タンパク質受容体をバイオ・ナノポアへ繫ぎ止めるためのフレキシブルなペプチド鎖(GGSGGS)を基本構造とする。
- ポアであるスキャフォールドは、大腸菌外膜においてフェリクローム に結合した鉄を輸送する受容体を短縮した455残基のt-FhuA (truncated Ferrichrome-iron Receptor Precursor)である (FhuAのPDB登録構造下図参照)。
- PPIは、タンパク質受容体に対するリガンドの結合または遊離に応じて変化するバイオ・ナノポアを介して流れる膜貫通電流の変化に基づいて同定する。
実証実験
- リボヌクレアーゼの一種で112アミノ酸からなるバーナーゼ barnase (Bn) をタンパク質受容体とし、Bnの活性を阻害する89残基のバースター(barstar, Bs)をリガンドとするモデルにて実証 (Barnase-Barstar複合体参考文献: PubMed 20211732)
- Bn-Bsに特異的な相互作用への感度向上の観点から、センサー基本構造に対してBnのN末端にOペプチド・アダプターを追加。
- Bnの結合はバイオ・ナノポア自体に影響を与えない
- Bsの可逆的結合を同定
- Bnに対する野生型のBsと結合親和性が低い変異型Bs (D29A)の結合親和性の差異同定を実現
- ウシ胎児血清中でのBn-Bs結合解析を実現し、細胞溶解物、血液および生検試料でのPPI解析ツールとしての可能性を呈示
今後の展開
- バイオ・ナノポアの多重並列化により、多様なタンパク質受容体のPPI多重同時測定や、ハイスループットな低分子薬剤やペプチド阻害剤スクリーニングへと展開
固体ナノポアまたはバイオ・ナノポアを利用したタンパク質センサー開発の試み
- "金属化 (metabolized)窒化ケイ素ナノポア + ニトリロ三酢酸受容体"センサー： "Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores" Wei R, Gatterdam V, Wieneke R, Tampé R, Rant U. Nat Nanotechnol. 2012 Mar 11;7(4):257-63.
- "α溶血素 (αHL)タンパク質ナノポア + 15-mer DNAアプタマー"センサー："Protein Detection by Nanopores Equipped with Aptamers" Rotem D, Jayasinghe L, Salichou M, Bayley H. J Am Chem Soc. 2012 Feb 8;134(5):2781-7. Online 2012-01-26.
- "ΑHLナノポア + ATP依存性プロテアーゼunfoldase"センサー："Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore" Nivala J, Marks DB, Akeson M. Nat Biotechnol. 2013 Mar;31(3):247-50. Online 2013-02-03.
- "溶血毒素Fragaceatoxin C (FraC)ナノポア"センサー："Electro-osmotic capture and ionic discrimination of peptide and protein biomarkers with FraC nanopores" Huang G, Willems K, Soskine M, Wloka C, Maglia G. Nat Commun. 2017 Oct 16;8(1):935.
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