1. CRISPR/Cas9 KOを介した基質合成抑制療法は代謝性疾患治療に有望である
[出典] "CRISPR/Cas9-mediated glycolate oxidase disruption is an efficacious and safe treatment for primary hyperoxaluria type I" Zabaleta N [..] Salido E, Gonzalez-Aseguinolaza G, Rodriguez-Madoz JR. Nat Commun. 2018-12-21.
  • 病因遺伝子のin vivo編集は未だ非効率であり、特に、編集した細胞のフィットネスが高くない場合は実用にならない。University of Navarraなどスペインの研究チームは今回、病因遺伝子編集に替えて、非必須酵素を標的とする基質合成抑制療法 (substrate reduction therapy, SRT)を試行した。
  • 対象の原発性高シュウ酸尿症I(primary hyperoxaluria type I, PHI)の遺伝子治療PHI は、稀な先天性グリオキシル酸代謝異常であり、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ (alanine-glyoxylate aminotransferase, AGT)の欠損により、肝臓にグリオキシル酸が異常蓄積し、腎疾患に至る。
  • PH1のモデルマウスであるAgxt1 (-/-)マウスにグリコール酸オキシダーゼ1 (Hao1)遺伝子を標的とするAAV8-CRISPR/Cas9を投与することで (原論文Fig. 1引用下図のa)参照)、シュウ酸の過剰生産と腎臓損傷を防止し、毒性は見られなかった。SRT
2. Broad研、SpyCas9によるゲノムワイドCRISPRa/CRISPRi/CRISPRkoにそれぞれ最適なsgRNAライブラリーを開発・提供
[出典] "Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities" Sanson KR, Hanna RE [..] Doench JG. Nat Commun. 2018-12-21;"Up, down, and out: optimized libraries for CRISPRa, CRISPRi, and CRISPR-knockout genetic screens" bioRxiv. 2018-06-27.
  • 細胞株、A375, HT29, K562に加えてMelJuSoを対象にした14件のスクリーンで検証
  • CRISPRko sgRNAs最適化ライブラリーBrunello (マウス版 Brie)、CRISPRi sgRNA最適化ライブラリーDolcetto (マウス版 Caprano)ならびにCRISPRa sgRNAs最適化ライブラリーCalabrese (マウス版 Dolomiti)を構築しAddgeneから提供
  • tracrRNAの最適化の必要性も示し (原論文Fig. 2引用左下図参照)、CRISPRkoとCRISPRiおよび、CRISPRa (原論文Fig. 5引用右下図参照)によるORF過剰発現も比較した結果、それぞれの手法が相補的であり、したがって、同一のサンプルについてコンパクトな (1遺伝子あたりより少数のsgRNAsで効率的編集可能な)ライブラリについて,複数の手法で解析することを推奨tracr-22021-04-29 15.37.07
3. オフターゲット抑制:Cas9/gRNAを発現後にCre-loP部位特異的組換えで除去するhit-and-runの手法を開発
[出典] "A lentivirus-based system for Cas9/gRNA expression and subsequent removal by Cre-mediated recombination" Carpenter MA [..] Harris RS. Methods. 2018-12-19.
  • University of Minnesotaの研究チームは、HIV由来レンチウイルスベクターの3'-LTRにloxPサイトを付加し、Cas9/gRNA複合体を発現するプロウイルスを誘導すると共に、逆転写過程を介してプロウイルスがloxPで囲まれ、Creによる切り出しを可能に
4.  血友病Bイヌのin vitroモデルに相同組換え修復をもたらすCRISPR/Cas9とドナーDNAの送達
[出典] "Viral vector-based delivery of CRISPR/Cas9 and donor DNA for homology directed
repair in an in vitro model for canine hemophilia B" Gao J [..] Ehrhardt A. Mol Ther Nucleic Acids. 2018-12-20.
  • ヒト肝癌由来の3種類の細胞株に、イヌ血友病Bの病因変異を帯びた凝固第IX因子(FIX)遺伝子を導入し血友病Bイヌのin vitroモデルを作出
  • Tet-onで誘導可能なSpyCas9-sgRNAと相同修復用ドナーDNAを同一のヒトアデノウイルスタイプ5 (HCAdV5)由来の高容量のアデノウイルスベクターで送達することで、CRISPR/Cas9を介した相同組み換え修復過程による遺伝子修復を実現、効率は5.52%に達した。この効率は、SpyCas9-sgRNAとドナーDNAを別々のベクターで送達する場合に優った。
5. SpyCas9(VQR)変異体はイネゲノムのNGAC PAMを認識する
[出典] "Cas9 protein variant VQR recognizes NGAC protospacer adjacent motif in rice" Xin GW, Hu XX, Wang KJ, Wang XC. Yi Chuan. 2018-12-20.  (中国語論文)
  • SpyCas9のVQR変異体 (D1135V/R1335Q/T1337R)は、イネゲノムのNGAA, NGAGおよびNGATをPAMとして認識されていたが、今回、SpyCas9(VQR)を改変しPAMとしてNGACも認識可能に
6. CRISPR/Cas13により植物に抗ウイルス性を付与する
[出典] "Engineering RNA Virus Interference via the CRISPR/Cas13 Machinery in Arabidopsis" Aman R, Mahas A, Butt H, Aljedaani F, Mahfouz M. Viruses. 2018-12-19.
  • シロイヌナズナゲノムに、Cas13とTurnip mosaic virus (TuMV)ゲノムを標的とするcrRNAを組み込むことで、表題を実現
7. バクテリアにおける天然物生合成遺伝子クラスタをCRISPR-Cas9でin vitro分解し、形質転換関連組換え(transformation assisted recombination, TAR)により再構成することで、生合成遺伝子クラスタを活性化
[出典] "Atolypenes, Tricyclic Bacterial Sesterterpenes Discovered Using a Multiplexed In Vitro Cas9-TAR Gene Cluster Refactoring Approach" Kim SH [..] Brady SF. ACS Synth. Biol. 2012-12-21.
  • バクテリアのゲノム解析やメタゲノム解析から発見される天然物生合成遺伝子クラスタのほとんどが研究室環境では活性を示さない。この課題をロックフェラー大学の研究チームは表題の手法で解決した。