2020-05-03更新 #1についてNature Communication論文刊行を受けて、Fig.1 を引用し、bioRxivに準拠していたテキストを整理
2018-12-29 初稿
1. CRISPR-Cas9 HDR効率を細胞周期アレスト誘導により向上
[出典] "Timed inhibition of CDC7 increases CRISPR-Cas9 mediated templated repair" Wienert B [..]  Richardson CD, Corn JE. bioRxiv. 2018-12-19 > Nat Commun 2020-04-30. 

 UC Berkeley, UCSFならびにUCSBの研究グループは、DNA代謝遺伝子~2,000種類を標的とするプール型CRISPRiスクリーンニングにより、二本鎖ドナー DNA (以下、dsDonor)に基づくHDRを調節する細胞内在因子を同定し、HDRの効率向上を実現した。
  •  BFPで標識したH562細胞に対して、dCas9-KRABとGFPを帯びたdsDonorプラスミド によるHDRを介したBFPGFPへの変換を見るCRISPRiスクリーニングのワークフローにより、ssDonorを利用した場合と比較評価した [Fig. 1 a 引用下図差参照]。Fig. 1
  • dsDonorとssDonorによるHDRはFanconi Anemiaを始めとするいくつかのパスウエイを共通に必要としていたが、双方が独自に必要とするパスウエイが存在することも明らかになった [上図右端参照]。
  • DSBのdsDonorに基づくHDRに必要とされる遺伝子群と、HDRを抑制する遺伝子群(CRISPRiノックダウンを受けたことでHDRの効率が向上した遺伝子) が、Figure 1 bにVolvano Plotでまとめられている [Figure 1 b 引用volcano plotの左側にHDR活性化遺伝子群,  右側に阻害する遺伝子群]Fig. 1 b[Fanconi Anemia関連crisp_bio記事:2018-08-07 FANCAが一本鎖アニーリングと相同鎖交換を触媒することで、DSBの相同組換え修復を亢進するCRISPRメモ_2018/07/30 1.ヒト細胞のCRISPR-Cas9ゲノム編集に、Fanconi anemiaパスウエイが関与する]。
  • 続いて、HDRを抑制する遺伝子群を阻害する低分子をスクリーニングし、細胞分裂周期7相同体タンパク質キナーゼ (cell division cycle 7-related protein kinase, CDC7) を阻害する低分子XL413が、初代T細胞を含む多くの細胞型でHDR効率を3.5倍まで向上することを見出した [上図volvano plot右側参照]。
  • また、XL413が S期早期における細胞周期アレスト誘導による細胞周期調節を介したHDRを亢進することを同定した。
  • XL413およびそれに類した低分子を利用することで遺伝子編集の効率をさらに高めていくことが可能である。
  • HDR効率と細胞周期調節関連crsip_bio記事:2018-04-15 細胞周期を制御することで造血幹細胞・前駆細胞における精密遺伝子修復を亢進する
2. MMEJを介して、CRISPR/Cas9による分裂酵母ゲノムへの効率的ノックインを実現
[出典] "Microhomology-mediated CRISPR/Cas9-based method for genome editing in fission yeast" Hayashi A, Tanaka K. bioRxiv. 2018-12-17. > "Short-Homology-Mediated CRISPR/Cas9-Based Method for Genome Editing in Fission Yeast" G3 (Bethesda) 2019-04-01
 CRISPR/Cas9による二本鎖DNA切断 (DSB)サイトの両側と相同な短い (6-40 bp)配列を帯びたドナーDNAを利用するMMEJ (Microhomology Mediated End Joining/マイクロホモロジー媒介末端結合)を介したノックインが、線虫、魚類およびヒト細胞株で実現されている。

 関西学院大学の研究チームは今回、誘導性プロモーターによるSpyCaS9の発現と短い (25 bp)相同DNAを組み合わせることでMMEJを介した分裂酵母染色体への点変異、エピトープおよびGFPタグの効率的な挿入を選択マーカに依存することなく実現した。下図は原投稿Fig. 1から引用したgRNAとgRNA-Cas9発現ベクターの構成)。fission yeast
[MMEJを介したゲノム編集関連crisp_bio記事]