CRISPRメモ_2019/03/26 (8件) : crisp

[crisp_bio注] 2019-03-26 8:30am: 項目8の出典の誤りを修正しました
1. 大規模な機能スクリーニングを実現する化合物誘導性CRISPR-Cas9システムを開発

[出典] "Development of drug-inducible CRISPR-Cas9 systems for large-scale functional screening" Sun N [..] Chung N. BMC Genomics. 2019-03-19.

AbbVie Incからの報告。活性を恒常的に維持しているCRISPR-Cas9と同等の編集効率を帯び、Cas9の活性を誘導する化合物が存在しない条件における活性 (バックグラウンド活性)がミニマルであるTet誘導性ならびにIPTG誘導性CRISPR-Cas9システムを構築・検証 (原論文Fig. 1引用下図参照)
EGFPをレポータとして、11種類のヒトとマウスの細胞株にてin vitro遺伝子ノックアウト、ならびに、造血機能再構築モデルマウスにおけるin vivo遺伝子ノックアウト
次いで、化合物誘導性のCRISPR-Cas9システムと恒常的に活性なCRISPR-Cas9を対象とするゲノムワイド機能喪失スクリーンの比較解析
さらに、PD-L1発現を正あるいは負に調節する因子を IFNγで処理したマウス結腸癌由来MC-38細胞を対象とするプール型CRISPRスクリーンにより同定

2. LION: CRISPR遺伝子編集用のsgRNAsを５時間で作成する手法

[出典] "LION: a simple and rapid method to achieve CRISPR gene editing" Xiang X [..] Luo Y, Lin L. Cell Mol Life Sci. 2019-03-18.

BGI-Shenzhenをはじめとする中国研究グループが、ゴールデンゲートアッセンブリー４時間とDNA精製１時間の２段階、計５時間で形質転換可能なCRISPRプラスミドを生成するLION (LIgation of double-stranded gRNA oligos into CRISPR vector by GGA followed by nucleic acid purifcatiON)を開発しその性能を実証

3. [プロトコル] E. coliにおける指向性進化法に基づく高精度なCas9作出を実現したSniper-screen

[出典] "Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution" Lee J, Jung MH, Jeong E, Lee JK. J Vis Exp. 2019-02-26.

オリジナル論文："Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity" Lee JK [..] Kim JS. Nat Commun. 2018 Aug 6;9(1):3048.
関連crisp_cas記事：2018-08-08ランダム変異導入から高精度・高活性なCas9変異体を開発 [第2項] 指向性進化法 (directed evolution)によりCRISPR-Cas9の精度を高めた"Sniper-Cas9"を開発

4. BE3を放線菌ゲノム編集に最適化 #塩基エディター

[出典] "CRISPR-BEST: a highly efficient DSB-free base editor for filamentous actinomycetes" Tong Y [..] Weber T, Lee SY. bioRxiv. 2019-03-20. > Highly efficient DSB-free base editing for streptomycetes with CRISPR-BEST. PNAS 2019-09-23.

Technical University of DenmarkとKAIST (兼務)の研究グループが、BE3 (rAPOBEC1-Cas9n (D10A)-UGI)をストレプトマイセス属にコドン最適化し、CRISPR-BEST (CRISPR-Base Editing SysTem)と命名し、シチジンとアデニンを対象とするCRISPR-BESTをそれぞれCRISPR-cBESTとCRISPR-aBESTと称した。

5. ストレプトマイセス属において、マルチコピー遺伝子の中の１コピーの特異的編集を実現

[出典] "Design of a generic CRISPR-Cas9 approach using the same sgRNA to perform gene editing at distinct loci" Najah S, Saulnier C, Pernodet JL, Bury-Moné S. BMC Biotechnol. 2019-03-20.

Université Paris-Saclayの研究チームは下図 (原論文Fig. 1から引用)にあるように、第1段階で標的の遺伝子コピーの近位に相同組み換えを介して後のCRISPR/Cas9による切断対象となる'bait'遺伝子を挿入し、第２段階で'bait'遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9で、野生型ゲノムにおける遺伝子コピーの逆位を誘導または削除を実現する。
この手法で、Streptomyces ambofaciensにおいて、外来遺伝子の発現を抑制するサイレンサーlsr2のパラログ２種類を対象とする編集を試み、どちらか一方のコピーが必須であることを同定

6. セルラーゼ生産糸状菌Trichoderma reeseiよるセルラーゼ以外の高純度タンパク質生産を実現　

[出典] "Novel genetic tools that enable highly pure protein production in Trichoderma reesei" Rantasalo A [..] Mojzita D. Sci Rep. 2019-03-22.

Trichoderma reeseiは、セルロース系バイオマスの利用に有用なセルラーゼを大量に生産・分泌する宿主細胞として利用されている。しかし、効率的なゲノム編集の技術と安定な遺伝子発現システムが存在しないことから、セルラーゼ以外のタンパク質生産には限界があった。
VTT Technical Research Centre of Finlandの研究チームは今回、研究チームが先行研究で開発していたsynthetic expression system (SES)に多重化CRISPR/Cas9技術を組み合わせることで、グルコースを炭素源として産業上有用なCandida antarctica由来リパーゼB (calB)を大量に生産する株を確立した。このT. reesei改変株は、セルラーゼ生産を抑制する培養条件で、不要な酵素を除去しつつ、高純度なcalBを4 g/Lのレベルで生産

7. プラスミドを新たに設計し、E. coliのssDNAリコンビアリングとCRISPR-Cas9により必須遺伝子dnaGの変異体を作出

[出典] "Coupling ssDNA recombineering with CRISPR-Cas9 for Escherichia coli DnaG mutations" Li J, Sun J, Gao X, Wu Z, Shang G. Appl Microbiol Biotechnol. 2019-03-16.

南京師範大学の研究チームは今回、クロラムフェニコール耐性遺伝子p15Aレプリコンに基づいて、IPTG誘導性RedオペロンとL-アラビノース誘導性cas9の双方を帯びたプラスミド pLS3535を設計・作出し、pLS3535による遺伝子編集後に、カナマイシン耐性遺伝子p15Aレプリコン系のプラスミドpLS3550によってpLS3535を除去；編集効率100%を達成し、目的としたリコンビニアリング効率の向上をもたらすDnaG変異を実現

8. 到穂日数と相関する一連のイネ遺伝子を対象とする同一遺伝的背景での機能比較を実現

[出典] "Assessment of the effect of ten heading time genes on reproductive transition and yield components in rice using a CRISPR/Cas9 system" Cui Y, Zhu M, Xu Z, Xu Q. Theor Appl Genet. 2019-03-19.