[出典] "Decoupling tRNA promoter and processing activities enables specific Pol-II Cas9 guide RNA expression" Knapp DJHF [..] Fulga TA. Nat Commun. 2019-04-02. (bioRixv 2018-06-08) [crisp_bio注] bioRxiv 2018-06-08版はCRISPRメモ_2018/06/13の第3項で紹介済み
背景
- CRISPR-Cas遺伝子編集技術開発の過程で、細胞に内在するtRNA前駆体の3'/5'末端を正確に切断する機構を利用して、tRNA-gRNAを多重にした合成gRNA (Polycistronic tRNA and CRISPR guide-RNA: PTG)*を送達し、gRNAを細胞内で発現させる手法が開発されていた (* Xie K, Nubjebverg B & Yang Y. PNAS 2015のFig. 1参照) 。
- University of Oxfordの研究チームは今回、細胞に内在するtRNAプロセッシングに基づくgRNA発現の時空間制御を目指した。
成果
- はじめに、tRNAバリアントのプロモータ強度ならびに5'/3'末端のプロセッシング効率を同時にスクリーン可能とするプラットフォームを構築し (原論文Fig. 1から引用した下図左の a/b参照)、HEK293T細胞において、tRNAがヒト細胞においてPol-III依存型プロモーターU6に近い活性を示すことを同定した (原論文Fig. 1から引用した下図右の c 参照)。すなわち、tRNAはtRNA外部のプロモーターとは独立にgRNAを恒常的に発現させることから、gRNA発現の時空間制御を実現するためには、tRNA内在プロモーター活性を排除する必要があることが示された。
- 次に、tRNAのバリアントをプラットフォームでスクリーンすることで、tRNAのTループやDループなどにおける1塩基変異がtRNAのプロモータ活性、3'末端プロセッシング、および5'末端プロセッシングに与える影響を分析し、３者に影響を与える変異は互いにほとんど独立であることを見出した。
- そこで、プロモーター活性が最小限でプロセッシングを損なわず、Pol-IIプロモーター (CMV)の有無に対して活性を明確にON-OFFする一連のtRNAバリアントをgRNA発現システムのスキャフォールドとして選定した (原論文 Fig. 3引用下図参照)。
- 選定したtRNAバリアントがCMV非存在下に対してCMV存在下で顕著なgRNA発現をもたらすことを、神経成長因子 (Nerve Growth Factor: NGF)のSAMによる転写活性化とPD-L1遺伝子の編集で実証した。また、CMVプロモーターをそのプロモーター強度がCMVの4分の1とされているPGKプロモーターに替えると編集効率が顕著に低下することも見出した。
- 本研究のtRNAバリアントによるgRNA活性化法を、先行研究のPol-IIを介したgRNA発現手法と比較した結果、エンドリボヌクレアーゼCys4を介してgRNAの活性を誘導する手法の最適化版(Ferry QR, Lyutova R, Fulga TA. Nature 2015のFigure ２参照)と同等であった以外は、その他のgRNA発現法に優ることを見出した (原論文Fig. 5-c引用下図参照: Csy4 Nano(+)と tRNAのΔC55Gを比較)。
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