CRISPRメモ_2019/04/26 (6件) : crisp

1. NHEJ過程を利用する新たなノックイン法

[出典] "Fast and cloning-free CRISPR/Cas9-mediated genomic editing in mammalian cells" Manna PT, Davis LJ, Robinson MS. bioRxiv. 2019-04-23.

HITI法(1)やVIKING法(2)をはじめとしてNHEJを介して効率的なノックインを実現する手法が開発されてきたところ、University of Cambridgeの研究チームは今回、Cas9-gRNAのオールインワンpx330プラスミドと、ノックインすべき配列の両端にgRNAの標的となる配列とPAMをノックイン先のゲノムと逆向きに結合したPCR産物とを、同時に送達するCHoP-In (CRISPR/Cas9-mediated, Homology-independent, PCR-product Integration) 法を開発した [ (1) HITI法：2017-05-06 非相同末端結合（NHEJ）によって、in vivo で非分裂細胞に外来遺伝子をノックイン；(2) VIKING法：CRISPRメモ_2018/01/15 4. VIKING：多用途な非相同末端結合（NHEJ）修復過程による高効率で多目的なノックイン法を開発（versatile NHEJ-based knock-in module for genome editing) ]。
Cas9がゲノムの標的部位とともにPCR産物の両端も切断することで、NHEJ過程を介したノックインが誘導される。
CHoP-In法によって、主としてHeLa細胞において、遺伝子のN末端、C末端および内部の蛍光タンパク質タギングを実現し、HEK293-T細胞とマウスNRK細胞でも同様の結果を得た。

2. AcCas12aはTTTV以外のモチーフもPAMとして認識する

[出典] "The Acidaminococcus sp. Cas12a nuclease recognizes GTTV and GCTV as non-canonical PAMs" Jacobsen T, Liao C, Beisel CL. FEMS Microbiol Lett. 2019-04-20.

無細胞転写-翻訳系 (transcription-translation: TXTL)に基づいたPAMスクリーンから、AsCas12a (AsCpf1)がGTTV、次いで、GCTVもPAM配列として認識することを同定し、哺乳類細胞におけるDNA切断活性も確認

3. [プロトコル]Hox遺伝子座にフォーカスしたCRISPR/sgRNライブラリを構築し、決定的なHox 遺伝子座におけるCTCF境界を同定

[出典] PROTOCOL "HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries" Luo H, Sobh A, Vulpe CD, Brewer E, Dovat S, Qiu Y, Huang S. J Vis Exp. 2019-03-31.

癌化や急性骨髄性白血病に関与するHOXA/B/C/D遺伝子間のCTCF結合サイトを同定

4. ヒト神経前駆細胞において、Zikaウイルス (ZIKV)感染の必須宿主因子群を、ゲノムワイドCRISPR KOスクリーンから同定

[出典] "Genome-wide CRISPR screen for Zika virus resistance in human neural cells" Lia Y, Muffat J, Javed AO, Keys HR [..] Jaenisch R. PNAS 2019-04-24.

ヘパラン硫酸化、エンドサイトーシス、小胞体プロセッシング、ゴルジ体およびインターフェロン活性に関わる宿主因子の変異が、ZIKVウガンダ株および北米株の感染に対する耐性をもたらす。

5. ブタのSPY遺伝子のHMGドメインの性転換機能

[出典] "The knockout of the HMG-Domain of the porcine SRY-gene by CRISPR/Cas RNP microinjection causes sex reversal in gene-edited pigs" Kurtz S [..] Petersen B. bioRxiv. 2019-04-24.

Friedrich-Loeffler-InstitutとHannover Medical Schoolの研究グループは、HMGドメインを標的とするCRISPR/Cas RNPのマイクロインジェクション実験に基づき、HMG-boxの削除が遺伝的にオスのブタをメスへと転換するが、HMGドメインの5'フランキング領域の欠損は性転換を誘導しないことを示した。

6. [特許] Cas9/dCas9による遺伝子編集/転写活性調節

[出典] PATENT "Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription" US20190106713 A1