（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/01/24）CRISPR関連文献メモ_2016/01/24
  • Corresponding author：真下知士（阪大/京大）
  • [３つの要素技術を開発]
    • poly(A)化：Cas9発現プラスミドにポリアデニン鎖を接合することで、ラット受精卵におけるCas9の発現を向上
    • lsODNの開発：これまでになく長い一本鎖オリゴ（lsODN）合成を実現
    • 2H2OP（two-hit by gRNA and two oligos with a targeting plasmid）：ラットDNAの２カ所を標的とするsgRNA２種類と、２カ所切断のHDRに利用する２種類の短い一本鎖オリゴ（ssODN）の組合わせ
  • [受精卵ゲノム編集の成果]
    • Cas9 mRNA、gRNAならびにssODN（1-kb）を注入して、ラットのThy1 遺伝子座にGFPをノックイン（1-hit 1-oligo: 1H1O）
    • ２種類のgRNAと2本のssODN（80-bp）を利用して、CAG-GFP配列（5.5-kbp）のベクターをラットのRosa26 遺伝子座にノックイン（2H2O）
    • ヒトSIRPA 遺伝子を含むBACプラスミド（〜200-kbp）のノックインとそれに付随したラットSirpa 遺伝子のノックアウト（2H2O）
    • 2H2Oを改変した3H2Oによって、ヒトのCYP2D6 遺伝子（6.2-kbp）のオーソログが存在すると思われるラットCyp2d1-5 遺伝子クラスター（58-kb）をCYP2D6 遺伝子に置換．ここで3H2Oは、Cyp2d1-5 遺伝子クラスターの上流と下流およびCYP2D6 遺伝子を含むプラスミドを標的とする３種類のgRNAsと、２本のssODN（120-bp）を意味．
  • 本手法は、これまでのHDRを利用するこれまでのノックイン法と異なり、相同アームを用意することなく、任意のベクターを任意の標的サイトにノックイン可能