（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/11/03）CRISPR関連文献メモ_2016/11/03
- Corresponding authors: Matthew D. Shoulders (Broad Inst/MIT); Amit Choudhary (Broad Inst/HMS/Brigham and Women’s Hospital)
- Cas9の性能を十二分に引き出すために、量、標的選択性、時間などの観点から多面的に精密に制御することが求められている。
- Cas9の用量の抑制や、目的とする遺伝子編集後迅速にCas9を不活性化することで、オフターゲット作用を低減する。
- 用量によって、dCas9による転写活性化を介したmRNA転写物のレベルを適切に調節する。
- 多重遺伝子の転写の互いに独立な調節を実現する。
- 研究チームは今回、CRISPR/Cas9システムにデグロン（degron）・ドメイン（以下 DD）を組み込み、デグロンを安定化する低分子を利用することで、Cas9による遺伝子編集とdCas9による転写調節の多面的制御を実現した。
- DDとしてEscherichia coli 由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、DHFR）を、DD安定化低分子としてトリメトプリム(trimethoprim, TMP)を使用して実証。
- HEK293T細胞において、DHFR-PP7(RNAアプタマー)-VP64（転写活性化因子）／dSpCas9／sgRNAsシステムをTMPにより制御。用量に応じた転写の活性化と、TMPの除去後８時間以内に誘導されたmRNAの転写物消失を確認。
- DHFR-PP7-VP64とTMTの組合せに加えてER50-M52-p65.HSF1sと4OHTの組合せを併用し、SpCas9それぞれ異なる遺伝子に向けることで、２種類の遺伝子の発現を互いに独立に制御。また、ER50の組みはSaCas9にも適用可能なことを確認。
- SpCas9のN末端とC末端の双方にDDを接続することで、SpCas9の効果的で用量依存性遺伝子編集活性を制御。また、TMPまたは4OHTの用量を最適化することでオフターゲット編集を抑制（オンターゲットへの高選択性を実現）。
- ここで使用した低分子は、安価で毒性がなく好ましい薬理特性を備え、また、TMPは血液脳関門を超える、という特長を備えている。
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