(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2014/12/01

[出典]

"Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9."  Nakade S, Tsubota T, Sakane Y [..] Sakuma T, Suzuki KT. Nat Commun. 2014 Nov 20;5:5560

プロトコル論文 Nat Protoc. 2016 Jan;11(1):118-33.

  • 広島大学などの研究グループは、相同組換え(homologous recombination, HR)に替えて、525bpの短い相同配列に依存するマイクロホモロジー媒介末端結合(Microhomology-mediated end joining, MMEJ)機構を利用する遺伝子ノックインの手法 PITCh (Precise Integration into Target Chromosome)法を開発した。
  • TALENPITchを組み合わせるTAL-PITCh法によって、ヒト培養細胞(標的はHEK293T細胞FBL遺伝子HeLa細胞β-actin遺伝子)ならびにカエル(Xenopus laevis))とカイコ(Bombyx mori)への外来DNAの効率的ノックインに成功した。
  • また、CRISPR/Cas9システムと組合わせたCRIS-PITCh法においては、3種類のガイドRNA(gRNA)と2種類のgRNAに対するターゲットサイトを有するベクターを用意し、HEK293TFBLをターゲットとするノックインに成功した。
  • 研究グループは、外来遺伝子を標的部位に正確かつ高効率で導入するPITCh法は、疾患モデルや医薬スクリーニングあるいは有用物質生産のための細胞・動物の開発に貢献していくとしている。

[参考]

ベクター LC008486: Synthetic construct mNeonGreen-2A-puroR gene for mNeonGreen, puroR, complete cds, note: TAL-PITCh_FBL

ベクター LC008487: Synthetic construct mNeonGreen-2A-puroR gene for mNeonGreen, puroR, complete cds, note: TAL-PITCh_ACTB

ベクター LC008488: Synthetic construct mNeonGreen-2A-puroR gene for mNeonGreen, puroR, complete cds, note: CRIS-PITCh_FBL

ベクター LC008489: Synthetic construct mNeonGreen-2A-puroR gene for mNeonGreen, puroR, complete cds, note: HR_ACTB

ベクター LC008490: Synthetic construct EGFP gene for EGFP, complete cds, note: TAL-PITCh_BLOS2

ベクター LC008491: Synthetic construct EGFP gene for EGFP, complete cds, note: TAL-PITCh_no29

ベクター LC008492: Synthetic construct EGFP gene for EGFP, complete cds, note: TAL-PITCh_fgk