[出典] "Inhibition of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex assembly by anti-CRISPR AcrIIC2" Thavalingam A [..] Wang Y, Maxwell KL. Nat Commun 2019-06-26.

概要
  • Karen L. Maxwell (University of Toronto)をはじめとしてErik J. Sontheime (University of Massachusetts Medical School)やJennifer A. Doudna (UC Berkeley)らは2016年と2017年にCell誌にて (crisp_bio 2016/12/162017/08/27参照)、Neisseria meningitidisのタイプII-C CRISPR Cas9 (NmeCas9)を特異的に阻害するAcrIICファミリーの同定といくつかのメンバーの特性を報告してきた。
  • 今回は、生物物理研究所 (北京)と中国科学技術大学も加わった共同研究グループとして、AcrIIC2Nmeが、N. meningitidis由来Cas9(NmeCas9; 論文中ではNme1Cas9と表記)の活性を阻害する分子機構が、X線結晶構造解析から得られた構造情報と生化学アッセイの結果から、AcrIIC1ともAcrIIC3とも異なる機構であることを、明らかにした。
構造
  • 6N05  Structure of anti-crispr protein, AcrIIC2 (2.5 Å)
  • 6JD7  Crystal structure of anti-CRISPR protein AcrIIC2 dimer (2.45 Å)
  • 6JDJ  Crystal structure of AcrIIC2 dimer in complex with partial Nme1Cas9 (2.6 Å)
  • 6JDX Crystal structure of AcrIIC2 dimer in complex with partial Nme1Cas9 preprocessed with protease alpha-Chymotrypsin (2.28 Å)
  • 原論文のFig. 3引用下図左と、FIG. 5引用下図右参照
AcrIIC2Nme functions as a homodimer AcrIIC2Nme
DNA切断活性の阻害機構
  • E. coliファージMuを標的とするアッセイから、AcrIIC2NmeがNmeCas9ならびに配列相同性が65%のHaemophilus parainfluenzae由来Cas9 (HpaCas9)の活性を完全に阻害するが、配列相同性が30%代のGeobacillus stearothermophilus由来Cas9 (GeoCas9)とCampylobacter jejuni由来Cas9(CjeCas9)に対する阻害能が極めて低いことが明らかになった。
  • Cas9のRECローブへのsgRNA結合に対してAcrIIC2Nmeが与える影響をアッセイし、AcrIIC2Nmeが、sgRNAのRECローブへの結合を阻害し、NmeCas9の分解が亢進することを見出し、補足実験の結果も踏まえて、AcrIIC2NmeがNmeCas9-sgRNA RNP複合体の形成を阻害すると判断した。
  • 続いて、等温滴定型カロリメトリー (ITC)法により、apo-NmeCas9に対するsgRNAの親和性はAcrIIC2Nmeの親和性よりも高いが、AcrIIC2Nme濃度を上げるに従って低下し、また、ゲル濾過により、AcrIIC2NmeがNmeCas9の10倍を超えるとNmeCas9-sgRNA複合体が形成されないことを見出した。
  • さらに、in vitro拮抗実験からも、NmeCas9-sgRNA複合体にAcrIIC2Nmeを加えた場合はCas9によるDNA切断は阻害されず、AcrIIC2NmeとsgRNAを同時に加えた場合は、AcrIIC2NmeをNmeCas9の10倍以上の条件でCas9のDNA切断活性が完全に阻害されることを見出した。
  • Cas9の各ドメインの欠損が活性に及ぼす影響をアセッイすることから、正電荷を帯びたNmeCas9のブリッジヘリックスとAcrIIC2Nmeの負電荷を帯びた表面との間の相互作用が、抗-CRISPR活性の構造基盤であることを同定した (左上の図のa-d参照)。さらに、アミノ酸置換実験から、この相互作用を担う一連のアミノ酸残基を同定した(左上の図のeとf参照)
  • NmeCas9とAcrIIC2Nmeの複合体構造と、NmeCas9とsgRNAの複合体構造の重ね合わせからAcrIIC2Nmeが、sgRNAのステムループの1と2のNmeCas9への結合を阻害することを同定した (右上の図参照)。
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