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｜CRISPR

2020-09-10 Nature Biotechnology 2020-09-07掲載論文へのリンクを追加
2019-07-11 bioRxiv 2019-07-09 投稿に準拠した初稿

[出典] "Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases" Jones Jr SK, Hawkins JA  [..] Finkelstein IJ. (bioRxiv 2019-07-09) Nat Biotechnol 2020-09-07.

　University of Texas at Austin, UC Berkeleyおよび高麗大学校の研究グループは、NucleaSeq (nuclease digestion and deep sequencing)を開発し、SpCas9 野生型, (wt) Cas9, とSpCas9改変型 3種類 (eSp1.1, Cas9-HF1 、Cas9-Hypa)およびAsCas12aのDNA切断動態プロファイリングと切断産物の時系列解析を実現し、CHAMP (chip-hybridized association-mapping platform) [* 参考crip_bio記事] により各CasヌクレアーゼのDNA結合特異性を解析した。
  • DNAライブラリーは、ランダム化したPAMまたはsgRNA対する不整合 (ミスマッチ、挿入または欠失のうち２種類まで)を帯びたバーコード付きの標的となるDNAsで構成し、規模は10,000種類を超えた。
  • DNA切断位置と切断産物のオーバーハングのトリミングが、各ヌクレアーゼ、gRNA配列およびgRNAと標的DNAのミスマッチの位置と塩基の種類によって変動していた。
  • 改変型SpCas9sは全て、オフターゲット結合プロファイルはwt Cas9と同様であったが、切断特異性は向上していた。
  • 改変型Cas9sの中でもCas9-HF1が、PAM遠位のミスマッチに対して、劇的な切断特異性向上を見せたが、Cas9-HF1の結合特異性向上は僅かであり、このCas9改変型の切断特異性向上は、R-ループ伝播後の切断過程が遅いことに拠ることが示唆された。
  • 意外にも、ヒト細胞内での標的特異性が高いAsCas12aのin vitro 標的特異性は、wtCas9と同程度であった。AsCas12aは、その切断速度がwt Cas9の10分の1~40分の1と遅いこと (今回の測定結果)から、細胞内に特有な因子 (転写因子またはクロマチンリモデリング因子)を介して切断が進行する前にオフターゲットサイトから遊離し、その結果、切断精度が向上することが示唆された。
  • NucleaSeqとCHAMPから得られた膨大なデータをもとに、オフターゲット切断の機構の解明と高精度なCas9ヌクレアーゼの設計に有用な生物物理学的モデルを構築し、各ヌクレアーゼについてオフターゲット切断の分子機構を論じた。
[参考crisp_bio記事]
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