CRISPRメモ_2019/07/17 (9件) : crisp

1. GEMINI: 変分法的ベイズ推定法に基づいて、プール型CRISPRコンビナトリアル・スクリーンから遺伝子間相互作用を再構成するアルゴリズム

[出典] "GEMINI: a variational Bayesian approach to identify genetic interactions from combinatorial CRISPR screens" Zamanighomi M, Jain SS, Ito T, Pal D, Daley TP, Sellers WR. Genome Biol 2019-07-12.

CRISPR-Cas9技術の登場によって、ヒト細胞において多重遺伝子を同時に編集するコンビナトリアル・スクリーンが可能になった。Broad InstituteとStanford Uの研究グループはは今回、２種類の遺伝子を標的とするsgRNAを組み合わせたライブラリーによるペアワイズ・ノックアウトスクリーンから、gRNAsやプロモータ強度の変動や、ライブラリー設計の如何に左右されずに遺伝子間ネットワークの再構成を可能とし、ひいては合成致死ペアの同定も可能とする、スケーラブルなアルゴリグムGEMINIを開発し、Rパッケージとして公開した。
GEMINI Rパッケージ入手先：https://github.com/sellerslab/gemini

2. Bindel-PCR: CRISPR/Cas9を介した両アレルノックアウト細胞を同定する新手法を、Thermus aquaticusDNAポリメラーゼを利用するPCRを介して実現

[出典] "Bindel-PCR: a novel and convenient method for identifying CRISPR/Cas9-induced biallelic mutants through modified PCR using Thermus aquaticus DNA polymerase" Sakurai T et al. Sci Rep2019--07-09.

Bindel-PCRは、biallelic KO mutants harbouring indels using PCRに因んだ命名 (原論文 Figure 1参照 )：マウスのEt1, Tyr, Ramp1, Ramp3およびRosa26遺伝子で実証

3. レンチウイルス・カプシドに基づくバイオ・ナノ粒子でCas9/sgRNA RNPを送達することで、効率的な‘hit-and-run’ ゲノム編集を実現

[出典] "Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient ‘hit-and-run’ genome editing" Lyu P, Javidi-Parsijani P, Atala A, Lu B. Nucleic Acids Res 2019-07-12.

CRISPR/Cas9システムの発現を一時的にすることでオフターゲット作用と免疫応答のリスクを低減可能である。
SaCas9 mRNAを100コピーまでパッケージ可能なレンチウイルス様バイオ・ナノ粒子 (lentivirus-like bionanoparticle, LVLP)を開発した[*]Wake Forest University Health Sciencesの研究グループは今回、LVLPによるSaCas9/sgRNA RNPの送達を実現し、Cas9 mRNA LVLPsと同等以上のindels生成効率を発揮することを確認した (原論文Figure 1引用下図参照)。
[*] CRISPRメモ_2019/02/28-1 [第2項] SaCas9 mRNAをレンチウイルス様バイオ・ナノ粒子で送達することでmRNAによる一時的かつ効率的ゲノム編集を実現

4. [レビュー] CRISPR/Cas9を介した突然変異誘発と優性突然変異トランスジーンによる病原性線虫の機能ゲノミクス

[出典] REVIEW "CRISPR/Cas9 mutagenesis and expression of dominant mutant transgenes as functional genomic approaches in parasitic nematodes" Lok JB (U Pennsylvania). Front Genet 2019-07-16.

C. elegansで実証されたCRISPR/Cas9技術のStrongyloides属とParastrongyloides属の機能ゲノミクスの成果と課題*および将来の展開をレビュー。特に、Strongyloides stercoralisの多機能調節因子Ss-DAF-16は、単なるノックアウト実験では、解析するにはあまりに複雑な表現型が生成され、そしてまたは、対象線虫が宿主感染能を失ってしまうことから、その機能解析を実現できない。この限界を超えるドミナントネガティブ作用をおよぼす遺伝子編集技術をとりあげた。
下図は原レビューのFigure 1とFigure 2からそれぞれ引用した病原性線虫への核酸送達戦略の図と優性突然変異導入による機能ゲノミクスのワークフロー

5. [プロトコル] CRISPR-Cas9を介した酵母染色体融合

[出典] "Creating functional chromosome fusions in yeast with CRISPR–Cas9" Shao Y, Lu N, Xue X, Qin Z. Nat Protoc 2019-07-12.

2018年8月に"Creating a functional single-chromosome yeast"をNature誌にて発表したShaoらによる詳細な実験プロトコル
オリジナル研究成果紹介crisp_bio記事：CRISPRメモ_2018/08/03 [第1項] CRISPR-Cas9による「切り貼り」でS. cerevisiaeの染色体16本を1本または２本へと再構成

6. 非モデル昆虫ホシカメムシへのCRISPR/Cas9ゲノム編集の展開と最適化

[出典] "CRISPR/Cas9 Genome Editing Introduction and Optimization in the Non-model Insect Pyrrhocoris apterus" Kotwica-Rolinska J [..] Dolezel D. Front Physiol 2019-07-15.

CRISPR/Cas9の非モデル生物への展開は、経験豊富な研究者にとっても、簡単では無い。特に、変異誘導効率が上がらないことが課題である。Biology Centre Czech Academy of Sciencesの研究グループは今回、ホシカメムシへの最適化に必要な条件を同定し(胚注入時期、ヘテロ二本鎖移動度分析による表現型に依存しない変異スクリーニング、sgRNAの効率のin vivo検証、G0世代モザイクスクリーニングなど)、他の昆虫にも、胚注入時期を除いて、展開可能とした (ワークフローの全貌について原論文Figure 5引用下図参照)。