[出典] "Pooled library screening with multiplexed Cpf1 library" Liu J [..] Draetta G. Nat Commun 2019-07-17. (bioRxiv 2018-11-19)

背景
  • Cas9を利用したプール型sgRNAsライブラリに基づくゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーンは、同一遺伝子を複数のsgRNAsで標的することで、ノックアウト効率を高めている。この手法は一方で、ライブリを複雑にし、ひいては人手、コスト増大をもたらす。
  • また、不活性なsgRNAを物理的に除去するおとが困難である。この問題はMAGeCKやBAGELといったアルゴリズムである程度軽減可能ではあるが、スクリーンからのヒット同定の障害となる。そこで、高効率なsgRNAsを設計することでライブラリのサイズを縮小することが試みられている。
概要
  • MD Anderson Cancer Centerの研究グループは今回、Acidaminococcus sp. Cpf1 (Cas12a)  (AsCpf1)の特徴を生かして、SpCas9と同等以上の効率を示すゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーンを可能とするこれまでで最小のプール型ライブラリMini-humanを構築した。このMini-humanは、1遺伝子あたり、crRNA前駆体を多重に組み込んだコンストラクト1本で構成される。
  • SpCas9に対してAsCpf1が帯びている特徴の中で特に、SpCas9と同等以上の標的選択性、crRNA単独 (tracrRNA不要)で短いガイドRNA (crRNA)で十分であり、Cpf1単独でcrRNAsを生合成する特長を活かし、かつ、SpCas9よりも低いとされていた哺乳類細胞での活性をSpCas9と同等にまで引き上げることで、実現した 。
予備実験:AsCpf1ライブラリの評価と調整
  • はじめに、ヒト慢性骨髄性白血病由来K562細胞株において、342種類のコア必須遺伝子と345種類の非必須遺伝子を標的とする3種類のライブラリの性能を比較した。1遺伝子あたり3種類のgRNAsに相当する2,061ガイド/687コンストラクトのAsCpf1マルチシストロニック・ライブラリ (AsCpf1-multi)と、SpCas9用のモノシストロニック・ライブラリ (SpCas9: 2,061ガイド/2,061コンストラクト)およびAsCpf1用のモノシストロニック・ライブラリ (AsCpf1-mono: 2,061ガイド/2,061コンストラクト)の活性を比較した (原論文Fig. 1 a-b 引用左下図参照)。
AsCpf1 1  Cpf1 1-2
  • この過程で、ギブソン・アッセンブリーを利用して構築したAsCf1の多重化ガイドRNAsには高頻度で発生した組換えが、古典的な制限酵素をベースにしたアセンブリにより抑制されることを見出した。また、核局在化シグナル配列として3x MYCを選択することで、ApCf1の活性ならびに必須遺伝子と非必須遺伝子の判別能が高まることも見出した。
  • 3種類のライブラリの性能を比較した結果、AsCpf1-monoはSpCas9に劣るが、AsCpf1-multiはSpCas9と同等以上であることを見出した (Fig. 1 c-f 引用右上図参照)
  • さらに、AsCpf1-monoのスクリーンからのデータに基づいて、gRNAの活性を予測可能とする配列のの特徴を抽出し、各遺伝子を標的とする最適化ガイドの選定の根拠となるスコア算定法を用意した。
Mini-humanによるゲノムワイド・スクリーニング
  • Mini-humanは、16,977種類のタンパク質コーディング配列を対象として、スコアから判定した最適化ガイド4種類を帯びた16,393コンストラクト、最適化ガイド3種類帯びた584コンストラクト、およびコントロールとして遺伝子を標的としないガイドを帯びた55コンストラクトの計17,032コンストラクトで構成されている。このライブラリのサイズはこれまで最小であったライブラリのほぼ4分の1にあたる。
  • Mini-humanライブラリの性能を、GeCKOv2 (123,411コンストラクト)ならびにゴールドスタンダードとされているWangライブラリ (Sabatiniデータセット; 187,536コンストラクト)と比較し、それぞれのライブラリに特有なヒットが存在するが概ね整合し、Mini-humanライブラリはWangライブラリに若干劣るが、GeCKOv2と同等であることを見出した (原論文引用下図参照)。AsCpf1 3
  • また、SpCas9の多重化にみられたような標的遺伝子のコピー数に関連する細胞毒性は見られなかった。