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科学分野の比較的新しい論文と記事を記録しておくサイト： 主に、CRISPR生物学・技術開発・応用 (ゲノム編集, エピゲノム編集, 遺伝子治療, 分子診断/代謝工学, 合成生物学/進化, がん, 免疫, 老化, 育種 - 結果的に生物が関わる全分野) の観点から選択し、時折、タンパク質工学、情報資源・生物資源、新型コロナウイルスの起源・ワクチン・後遺症、機械学習・AIや研究公正からも選択

｜CRISPR , 最終更新2022年PDISニュースウオッチ・アーカイブ

（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/12/23）
  1. [論文] LIG4 遺伝子を標的とするshRNAをCRISPR/Cas9システムに組込む
    • Corresponding author: Zhiying Zhang (Northwest A&F U.(西北農林科技大學))
    • 本手法は、U6プロモーターの下流に、RNase III系酵素のDroshaの切断サイトを挟み込んだsgRNAとshRNAのアレーを配置したコンストラクト（参考図参照）43530001
      を用意し、内在Droshaを介して、細胞内で活性なsgRNAsとshRNAsを生成し、sgRNAsによってCas9を複数のゲノム編集標的サイトにガイドし、shRNAsによって関連する機能遺伝子のサイレンシングを可能にする。
    • 293T細胞を対象として多重編集については、３箇所の遺伝子座の同時編集を効率9%で実現した。また、DNAリガーゼIV遺伝子（LIG4 ）を標的とするshRNAを組み込むことで相同組換え修復（HDR）機構による精密なゲノム編集の効率を２倍まで向上させた。
  2. [論文] I-TevIとCas9の２重ヌクレアーゼによって、ゲノムから一定の長さを削除
    • Corresponding author: David R. Edgell (Western University)
    • I-TeVIのヌクレアーゼドメイン（1−92残基）とリンカードメイン（92-169残基）をSpCas9のN末端に結合した２つのヌクレアーゼを備えた“TevCas9”によって、標的サイトからの削除を一定の長さ（33-bpまたは36-bp）に収斂することを可能にした。
    • SpCas9単独の場合、dsDNA開裂の非相同末端結合（NHEJ）過程による修復と再開裂のサイクルが繰り返され、gRNAの標的サイトを含む長短さまざまな欠損を帯びた細胞が集団が生成される。TevCas9の場合、２種類のヌクレアーゼによる２カ所のdsDNA開裂の結果発生するDNA末端が相互に適合しないことから、修復・再開裂のサイクルを回避することができる。
  3. [論文] 精密なゲノム編集技術によって、パスウエイのスワップも可能になる
    • Corresponding author: Pascale Daran-Lapujade (Delft University of Technology)
    • 合成生物学によって代謝パスウエイ全体を産業微生物に１段階で組み込むことが可能になったが、中央代謝系の改変は、微生物ゲノム上に分散してコードされていることから実現されていなかった。今回、CRISPR/Cas9を含むゲノム編集技術を利用して、中央代謝系の改変を可能にする“pathway swapping”が可能なことを、Saccharomyces cerevisiae の解糖系をモデルとして実証した。
  4. [Communication] 合成ナノ粒子によるCas9 mRNAとsgRNAの同時送達
    • Corresponding author: Daniel J. Siegwart (U. Texas Southwestern Medical Center)
    • 両性界面活性剤の一種であるzwitterionic(双性イオン性)スルホベタインのヘッドグループ、アミン・リッチなリンカー領域および疎水性テールで構成される合成“zwitterionic amino lipids（ZALs）”によって、Cas9 mRNAとsgRNAsの双方を含む長いRNAsの送達を実現。
    • 低用量（15nM）のsgRNAをZALナノ粒子（ZNP）で送達することで、90%以上の細胞においてタンパク質発現を低減。また、一過性のRNAi処理と対照的に、タンパク質発現の95%低減を永続的に維持。一方で、ZNPによって低用量（in vitro 600 pM未満；マウスin vivo 1 mg/kg）のmRNAを送達することで、タンパク質の高発現を実現。さらに、Lox-Stop-Lox tdTomatoカセットを全細胞に組込んだマウスに、ZNPによってCas9 mRNAとsgLoxPを同時送達することで、flox化蛍光タンパク質tdTomatoが発現することを、肝臓、腎臓および肺で確認。
  5. [プレビュー] CRISPR/Cas免疫はクオラムを感知して応答する
    • Corresponding author: Konstantin Severinov (Waksman Inst. Microbiology/Skolkovo Inst. Science and Technology)
    • 微生物は、コストの高いCRISPR/Casシステムを維持し、また、CRISPR/Casが常時活性化することのリスクを回避し、必要に応じてその獲得免疫応答機構を活性化すると考えられる。CRISPR/Casシステムの活性化とクオラムセンシングの相関に関するPattersonらのMolecular Cell 掲載論文と、Høyland-KroghsboらのPNAS 論文をハイライトし、LiらのCell Research 論文にも言及。
    • [関連記事]
      • Patterson論文：CRISPR関連文献メモ_2016/11/22 1.[論文] クオラムセンシング（quorum sensing; QS）が多重なCRISPR/Casシステムの調節を介して獲得免疫反応を制御する
      • Høyland-Kroghsbo論文：CRISPR関連文献メモ_2016/11/21 2.[論文] クオラムセンシングに依存するCRISPR/Casシステム活性化機構から新たな感染症対策
      • Li論文：CRISPR関連文献メモ_2016/11/24 3.[論文] Pseudomonas aeruginosa のI型CRISPR/Casは、宿主に対する毒性を調節する
  6. [論文] CRISPR/Cas9を介した標的エクソン中の１塩基変異に起因する複数エクソンのランダムなスプライシングが遺伝子ノックアウトをもたらす
    • Corresponding author: Ritva Tikkanen (U. Giessen)
    • CRISPR/Cas9による遺伝子ノックアウトは、dsDNA開裂とその非相同末端結合（NHEJ）修復の際に生じるindelsがもたらすフレームシフト変異に由来するとされている。研究チームは今回、CRISPR/Cas9が標的エクソンに導入する変異が、mRNA前駆体（pre-mRNA）にオルターナティブ・スプライシングを誘導し、異常なタンパク質の発現にもつながることを、FLOT1 遺伝子をモデルとして、見出した。
  7. [論文] タイプIII-BのCRISPR/Casエフェクター複合体は、標的DNAの大量破壊を誘導する
    • Corresponding author: Qunxin She (U. Copenhagen/Huazhong Agricultural U.)
    • ６種類のタイプに分類されているCRISRP/Casシステムの中で、タイプIII CRISPR/CasシステムにはDNAとRNAの双方を標的とするエフェクターが多数属している。
      • タイプ: 由来するバクテリアまたはアーケア III-A: Staphylococcus epidermidis ; Streptococcus thermophilus ; Thermus thermophilus
      • III-B: Sulfolobus islandicus ; Thermus thermophilus ; Pyrococcus furiosus
      • III-D: Sulfolobus solfataricus
    • 研究チームは先行研究で、S. islandicus タイプIII-BのCasエフェクターCmr-αが、プロトスペーサーからのアンチセンス鎖の転写に依存してDNA切断することを見出していた。今回、その野生型と変異体のin vitroでのDNA切断活性とRNA切断活性を測定し、Cmr-αの侵入核酸分解の分子機構を分析した。
    • Cmr-αはcrRNAと相補的な侵入RNAsを標的と切断し、標的RNAによってそのssDNA切断活性が活性化された。このssDNA切断には、crRNAの5’末端タグと標的RNAの3’隣接領域との間にミスマッチが起きていることが必要であった。
    • Cmr-2αタンパク質のHDドメインまたはGGDDモチーフに変異が起こるとin vivo でのDNA切断活性が減衰した。一方で、in vitro では、HDドメインにおける二重変異のみがDNase活性を消滅させた。さらに、in vitro において、活性化したCmr-αは極めて活性なDNaseとして機能し、過剰なDNA基質を大量に分解することが可能であった。この機能によって複製されるウイルスDNAが急速に分解されることが示唆される。
    • [情報拠点注] タイプIIICRISPR/Casシステム関連ニュースウオッチ記事
  8. [論文]　CRISPR/Cas9 RNPの送達により外来DNAが混入・残存しないブドウとリンゴのゲノム編集を実現
    • Corresponding authors: Mickael Malnoy; Chidananda Nagamangala Kanchiswamy (Genomics and Biology of Fruit Crop Department, Fondazione Edmund Mach)
    • CRISPR/Cas9システムの植物細胞への送達は効率的であるが、プラスミドの配列がランダムに宿主ゲノムに組込まれるリスクを伴う。また、現在のGMO規制に抵触するリスクもある。研究チームは今回、CRISPR/Cas9リボ核タンパク質（RNPs）をブドウ栽培種Chardonnay とリンゴ栽培種Golden delicious のプロトプラストへ直接送達することで、外来DNAの混入を回避しつつ効率的な標的変異導入を実現した。
  9. [成書] 遺伝的摂動法：酵母遺伝学の’フォース’からCRISPR革命へ
    • Corresponding authors: Gregory R. Hoffmann; Dominic Hoepfner (Novartis Inst. BioMecial Research)
    • 酵母をモデルとして順遺伝学の手法による疾患治療の標的となる遺伝子の同定または治療に有用な化合物の作用機序の分析を解説
    • [情報拠点注] 記事タイトル中の’フォース’はオリジナルの章のタイトル中の’Awesome Power’の意訳（’フォース’についてはスターウオーズ参照のこと）。
  10. [特許] Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
１ 論文→Qiang Yan et al. “Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure.” Sci. Rep. 2016 Dec 12;6:38970.
２ 論文→Jason M. Wolfs et al. “Biasing genome-editing events toward precise length deletions with an RNA-guided TevCas9 dual nuclease.” Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. Published online before print 2016 December 12.
３ 論文→Niels G. A. Kuijpers et al. “Pathway swapping: Toward modular engineering of essential cellular processes.” The Royal Society of Chemistry. Published online before print 2016 December 12.
４ Communication→Jason B. Miller et al. “Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.” Angewandte Chemie International Edition. Published online 2016 December 16.
５ プレビュー→Ekaterina Semenova & Konstantin Severinov. “Come Together: CRISPR-Cas Immunity Senses the Quorum.” Mol. Cell. 2016 Dec 15;64(6):1013-1015.
６ 論文→Marcel Kapahnke, Antje Banning & Ritva Tikkanen. “Random Splicing of Several Exons Caused by a Single Base Change in the Target Exon of CRISPR/Cas9 Mediated Gene Knockout.” Cells. 2016 Dec 14;5(4).
７ 論文→Wenyuan Han et al. “A type III-B CRISPR-Cas effector complex mediating massive target DNA destruction.” Nucl. Acids Res. 2017 Feb 28;45(4):1983-1993. Published online 2016 .
８ 論文→Mickael Malnoy et al. “DNA-Free Genetically Edited Grapevine and Apple Protoplast Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins.” Front. Plant Sci. Published online 2016 December 20.
９ 成書→Gregory R. Hoffmann & Dominic Hoepfner. “Genetic Perturbation Methods, from the 'Awesome Power'of Yeast Genetics to the CRISPR Revolution.” in “High Throughput Screening Methods: Evolution and Refinement.” edited by Joshua A. Bittker & Nathan T. Ross. The Royal Society of Chemistry 2017.
10 特許→US 9512446 B1. “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases” Filing Date 02/04/2016. Publication Date 12/06/2016.
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