[出典] "Large dataset enables prediction of repair after CRISPR–Cas9 editing in primary T cells" Leenay RT, Aghazadeh A, Hiatt J [..] Marson A, May AP,  Zou J. Nat Biotechnol. 2019-07-29.

　Cas9が誘導するdsDNA切断からの修復結果の予測は、特にヒト初代細胞については、未だ困難である。UCSF, Stanford U, Chan–Zuckerberg Biohubなど米国研究グループは今回、ヒト初代T細胞ゲノム編集の実験結果に基づいて、修復結果に発生するヌクレオチドの挿入・欠失のサイズ、誘導確率および配列を精密に予測する機械学習モデルSPROUT (CRISPR Repair Outcome)を構築した。

　18名の健常者 (ドナー)に由来するCD4陽性初代T細胞へ、556種類の遺伝子内のべ1,656ヶ所を標的とするSpCas9-gRNAs RNPをエレクトロポレーションし、その6日後にDNAを抽出・増幅し、標的サイトの180- から260- bp領域をPCR後にシーケンシングし、CrispRVariants [*1]によって標的サイト領域に発生する挿入・欠失のプロファイルを判定した。

　研究グループは、標的サイト間の切断結果の変動が大きいことは、切断サイトに近い領域における配列の多様性に由来するという仮説のもとに、勾配ブースティング (Gradient boosting)アルゴリズムに基づいて、20-ntのスペーサ配列とPAM配列を入力として、挿入または欠失、および挿入・欠失のサイズを予測するSPROUTを開発した。

　研究グループはまた、SpCas9標的サイトの90%において、長い (> 25 bp)挿入DNAを見出した。その27%が標的サイトから1 kb以内の配列に由来し、9%が同一染色体の領域に由来し、残りは全て、Hi-C解析から標的サイトと相互作用すると推定される他の染色体ゲノム領域に、アラインしたことから、SpCas9によるdsDNA切断からの修復時には、細胞空間で物理的に近い距離にあるゲノムに由来するDNA断片が、取り込まれることを示唆した。