ZFNのオンターゲット編集活性を損なわずオフターゲット編集活性を検出限界未満まで抑制する変異導入 : crisp

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[出典] "Enhancing gene editing specificity by attenuating DNA cleavage kinetics" Miller JC [..] Rebar EJ. Nat Biotechnol 2019-07-29.

　部位特異的ヌクレアーゼによりゲノム編集の効率が格段に向上したが、標的に対する特異性は未だ改善すべき課題として残っている。臨床応用には特に、オフターゲットの切断を回避することが必須である。Sangamo社の研究グループは今回、ZFNsの特異性の向上を、CROSPR-Cas9の切断活性を減弱することでオフターゲット編集を抑制するCRISPR-Cas9の特異性をCas9の切断活性を弱めることでオフターゲット編集を抑制する手法に倣うことで、実現した。

研究グループは始めに、 K562細胞のセーフハーバー遺伝子座AAVS1と4種類の既知のオフターゲット (OT1-4)のZFN編集を測定する系において、オンターゲット編集の効率を向上し、オフターゲット編集を抑制する一連の残基置換を同定し、中でもFokI触媒活性ドメインにおけるQ481Aが、オフターゲット切断活性に対して~3,000倍を超えるオンターゲット切断活性(OT1:85.5%/0.0024%=35,600)をもたらすことを同定した。
こうしたFokIの残基置換によって、Fok1の触媒反応速度を抑制し、ひいてはZFNの結合親和性が相対的に低いオフターゲットの編集効率を効果的に抑制することに成功した。
研究グループはさらに、ジンクフィンガー・モチーフのDNAへの非選択的結合を回避する置換を同定し、オフターゲットへの結合親和性自身の抑制も加えた。
この２重のZFN改変により、オフターゲット編集を検出限界未満 (感度 ~0.01%)にまで抑制しつつ、T細胞におけるTRAC 遺伝子座のノックアウト効率 > 98%を実現し

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