CRISPR関連文献メモ_2017/01/04（５件） : crisp

（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2017/01/04）

[RESEARCH HIGHLIGHT] ゲノム編集活性のオフ・スイッチ
- CRISPR/Cas9の天然のオフスイッチを報告したPawlukらのCell 論文をハイライト：
  - Pawluk , A. et al. “Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9.” Cell. 2016 December 15;167(7):1829-1838.e9. Published online 2016 December 8.
  - ニュースウオッチ記事：CRISPR関連文献メモ_2016/12/16 2.[論文]　CRISPR/Cas9活性の天然オフ・スイッチ
- 抗CRISPRタンパク質に関連する論文とニュースウオッチ記事
  - Rauch, B. J. et al. “Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins” Cell. Available online 29 December 2016
    CRISPR関連文献メモ_2016/12/31 1.[論文] Cas9活性制御に展開可能なバクテリオファージ由来・抗CRISPRタンパク質
  - April Pawluk, Raymond H.J. Staals, Corinda Taylor, Bridget N.J. Watson, Senjuti Saha, Peter C. Fineran, Karen L. Maxwell & Alan R. Davidson. “Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species” Nat. Microbiol Published online 2016 June 13.
    CRISPR関連文献メモ_2016/06/18 2.[論文] 抗CRISPRタンパク質によるバクテリアCRISPR-CASシステムの不活性化
[論文] Escherichia coli のCas1-Cas2インテグラーゼとプロトスペーサーおよびアクセプターDNAの三者複合体形成機構
- Corresponding author: Pierre Plateau (Université Paris-Saclay)
- ゲルシフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)）を利用して、Cas1-Cas2とプロトスペーサーおよびアクセプターとなるプラスミドDNAとの間の複合体形成を、in vitro で追跡し、CRISPR遺伝子座を有しスーパーコイル状のアクセプターDNAの場合に、長時間安定な三者複合体が形成されることを見出した。
- Cas1-Cas2のアクセプターDNAへの結合は、プロトスペーサーの存在によって亢進されるが、安定な複合体形成には、プロトスペーサーが、5塩基より長い3’末端一本鎖オーバーハングを持たないことが条件であった。
- CRISPR遺伝子座への変異導入実験から、CRISPR遺伝子座に隣接するリーダー配列の存在の如何によらず、リピートのパリンドロミック・モチーフが１つ存在すれば、安定な三者複合体が形成されることが明らかになった。
[論文] CRISPR/Cas9によるPAF53ノックアウト実験はPAF53が哺乳類細胞の生存に必須であることを示唆した
- Corresponding author: Lawrence I. Rothblum (U. Oklahoma College of Medicine)
- 栄養そしてまたは成長因子の欠乏下の哺乳類細胞では本質的にrDNAの転写が停止するが、1996年にPAF53が特定のrDNA転写に必須であり、PAF53のレベルが成長因子に制御されることが報告されていた（Hanada et al., 1996）。脊椎動物PAF53の酵母ホモログA49は、酵母の生存には必須ではないが“最適な増殖に必須”であると報告された（Wang et al., 2015）。研究チームは今回、PAF53が細胞生存に必須か否かを確定することを目的として、CRISPR/Cas9技術による遺伝子産物のノックアウト実験を行った。
  - ヒト293細胞においてPAF53の第２エクソンを標的とするsgRNAによるノックアウトを試みた。また、FLAG標識したマウスPAF53をコードしたプラスミドをCRIPR/Cas9システムと同時に感染させてその効果を見た。
  - ヒトのPAF53を発現しない細胞は、マウスPAF53の異所性発現が存在しない場合に限られていた。すなわち、細胞は、リコンビネーションまたはオルターナティブリーディングフレームを介した独特の機構によってPF53を発現し、PAF53が細胞生存に必須であることを示唆した。
[論文] CRISPR/Cas9システムによって、分裂終了細胞におけるシナプトブレビン/シナプス小胞結合膜タンパク質（synaptobrevin/VAMP）機能を阻害
- Corresponding author: Lisa M. Monteggia (U. Texas Southwestern Medical Center, )
- Synaptobrevin 2（Syb2/VAMP2）を標的とするCRISPR/Cas9レンチウイルスを初代培養海馬ニューロンに感染させることで、Syb2タンパク質と免疫組織化学的染色を劇的に低減し、Syb2が多くの終末ボタン（boutons）で検出されなくなり、また、編集された初代培養海馬ニューロンがSyb2がノックアウトされたニューロンの表現型を再現することを見出した。
- CRISPR/Cas9を高効率なレンチウイルスで感染させることで、ニューロンの大部分でSyb2をノックアウト可能であり、この手法は、分裂終了後ニューロンにおける細胞非自律的シナプス前の表現型の解析ツールと成り得る。
[特許] Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding CRISPR related proteins and synthetic sgRNAs and methods of use.
- 発明者：Hoge, Stephen (Cambridge, MA, US); Yi-chun, Eric (Cambridge, MA, US); Chakraborty, Tirtha (Cambridge, MA, US)
- 譲受人：Moderna Therapeutics, Inc. (Cambridge, MA, US)