[出典] "Highly Parallel Profiling of Cas9 Variant Specificity" Schmid-Burgk JL, Gao L, Li D [..] Zhang F. Mol Cell 2020-03-17.
- Feng Zhangが率いる研究グループが今回報告したTTISSはTagmentation-based tag integration site sequencingに由来する命名。
- Casが誘導するDSBサイトにタグとしてdsODNを内在NHEJ過程を介して挿入することで、ゲノム全域にわたってDSBを偏り無く同定する手法であるGUIDE-seqを、60種類のgRNAsの同時利用へと拡張し、Tn5トランスポザーゼによるバルクでの断片化 (tagmentation)を介して、TTISSを実現した。
- HEK293T細胞、U-2 OS細胞およびK562細胞において、59種類の標的を対象とするTTISSにより、野生型 (WT) SpCas9, eSpCas9(1.1), SpCas9-HF1, HypaCas9, evoCas9, xCas9(3.7), Sniper-Cas9ならびにHiFi Cas9のオンターゲット活性とオフターゲット編集を評価した。
さらに、その結果に基づいて、高性能なCas9変異体の変異を組み合わせさらに10ラウンドの変異誘発実験を経て得た新たな変異体LZ3 Cas9をTTISSで評価し、その結果に基づいて、各変異体を、オンターゲット活性と特異性の２次元空間に位置づけた [Graphical Abstract引用下図参照]。
GUIDE-seq
- crisp_bio 2017-04-16 CRISPR-Casヌクレアーゼのオフターゲット効果をゲノム全域にわたって俯瞰可能にするGUIDE-seq
- "GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases" Tsai SQ, Zheng Z [..] Joung JK. Nat Biotechnol 2014-12-16.
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