C-to-TとA-to-Gの共変換を実現するBE: SPACE (ヒト細胞) : crisp

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[出典] "A dual-deaminase CRISPR base editor enables concurrent adenine and cytosine editing" Grünewald J, Zhou R [..] Joung JK. Nat Biotechnol 2020-06-01.

[注] SPACEはCRISPR-Cas9-based synchronous programmable adenine and cytosine editorに由来する。

　Massachusetts General Hospital/Harvard Medical SchoolのJ. Keith Joungが率いる研究グループは、先行研究において、RNAオフターゲット変換を最小限に留め、またTdA/TdA*からTdAを除去した小型のminiABEmax-V82G [1]を開発していた。

SPACEの構成
　研究グループはminiABEmax-V82Gの特長を活かし、SpCas9 D10AのN末端に結合されていたアデノシン・デアミナーゼと、Target-AID [2]のシチジン・デアミナーゼを融合することから、標題共変換を可能とするBEの開発を始めた (Target-AIDのシチジンデアミナーゼはC末端に結合されていたことも好都合であった)。また、シトシン変換の純度を高めるためにBE4に倣ってUGIを2コピー導入した。

SPACEの性能評価

　HEK293T細胞の28ヶ所の標的 (gRNAs)にて、miniABEmax-V82G、Target-AIDおよびそれらのミックスと比較した。

A-to-G: miniABEmax-V82Gが変換した26ヶ所のうち25ヶ所; 変換効率は、miniABEmax-V82G (平均18.1%, 0.06–70.82%)に対して平均13.07% (平均13:07%, 0.03–71.33%)であった。
C-to-T: Target-AIDが変換した28ヶ所全て; Target-AID (平均24.82%, 0.28–70.32%)に対して(平均22.13%, 0.3–69.98%)であった。
SPACEの変換ウインドウは、miniABEmax-V82GとTarget-AIDよりも若干狭まり、A-to-GとC-to-Tの変換は、PAMに対する相対位置で主として4–7と2–7の位置で進行した。
オンターゲットでの設計通りの変換とindels発生頻度については、SPACEはminiABEmax-V82GまたはTarget-AIDと同等であった。
単一のBEであるSPACEによる共変換の効率は、miniABEmax-V82GとTarget-AIDの共発現 (ミックス)による共変換効率を上回り、オンターゲットへの望ましくないindels誘導率では下回った。
RNA-seq解析から、miniABEmax-V82GとTarget-AIDで実現されていたRNA変換の抑制がSPACEに継承されたことが示された。また、DNAオフターゲットについもアプリコンシーケンシングから、一体化に伴う悪化の傾向は見られなかった。

SPACEの応用

病因となる多重変異 (multi-nucleotide variants, MNV)の修復が容易になる (MNVで最も高頻度なヌクレオチドは、TG-to-CAと CA-to-TGである)。
SPACEは従来のCBEとABEよりも塩基配列およびコドンの多様化に効果的であり、細胞系譜追跡、飽和突然変異誘発スクリーン、指向型進化、タンパク質工学あるいは転写因子結合サイト生成 [Extended Data Fig. 8参照]へと活用可能である

引用crisp_bio記事