[出典] Structure-based design of gRNA for Cas13. Bandaru S [..] Ito T. Sci Rep 2020-07-14.
Cas13 (C2c2)エンドヌクレアーゼは、2つのHEPN RNaseドメインを帯び、crRNAと複合体を形成し、crRNAの標的となるRNAを切断(cis-切断)すると共に、標的以外のssRNAsを無差別に切断(trans-切断)するエフェクターとして機能する [1-2]。Trans−切断活性は、コラテラル活性とも呼ばれ、SHERLOCK [3]を代表とする超高感度核酸検出法に活用されている。
川崎医科大学に岡山大学と福井大学が加わった研究グループは、Cas9エンドヌクレアーゼが二本鎖DNA (dsDNA)を部分的に巻き戻すのと対照的に、Cas13は二本鎖RNA (dsRNA)を巻き戻さないためにcrRNAの二本鎖 (DS)領域への結合が阻害され、ひいては、Cas13が二本鎖RNA (dsDNA)の切断活性を示さないとし [4]、XIST転写物をモデルとして、構造-配列データと構造予測に基づいて、RNA鎖の中でRNAの一本鎖 (SS)領域を標的とするgRNAの合理的設計法を開発し、その効果を実証した。
- XIST転写物をモデルに選択したのは、19,245-bpの長さのlncRNAであり、SS領域のループ構造とDS領域のステム構造を帯びている可能性が高く、また、構造-配列相関データ [5]が詳らかにされている。このデータに基づいてRNAstructure (v 6.0.1)を利用して可視化した2次構造を介して、SS領域、DS領域、およびSS-DS領域 (ステムとループの結合部位)を標的とするgRNAsを設計し、HEK293T細胞で検証した [Figure1 右図参照]。
- Cas13としてはヒトに最適化したLshCas13aを使用し、SS領域を標的とするgRNAにd基づくcrRNA-Cas13エフェクターの顕著な切断活性とXISTノックダウン活性を確認した。 [Figure 2 引用左下図参照]。
- さらに、SS領域とDS領域の境界にわたるgRNAの活性と、各領域との重なり具合との相関を分析することから、活性に決定的な影響を及ぼすcentral seed regionとして、標的領域 (プロトスペーサ)の中央部の11-18-bpを同定した [Figure 4 引用右上図参照]。この領域を帯びた20-28 ntの範囲の長さのgRNAsはいずれも有効である。
- プロトスペーサの3'末端に隣接する配列については、Gの場合に僅かに活性が低下したが、Cas9-sgRNAシステムとは異なり、顕著な依存性は見られなかった。
- crRNA-Cas13がSS領域に対して切断活性を示すことが確定したことから、IPknot [6]により予測したXIST転写物上のシュードノットを標的とするgRNAsを設計し活性を評価したが、XISTノックダウンには影響しなかった。
- 構造-配列相関データが存在しない転写物についても実証実験を行った。二相型滑膜肉腫に見られるSS18-SSX2融合転座転写物t(X;18)(p11;q11)の構造をin silico予測し、SS領域とDS領域を標的とするgRNAsを設計し、SS領域を標的とするgRNAsに基づくcrRNA-Cas13がSYO-1 細胞を顕著に壊死させることを同定した [Figure 7引用右図のGuide 1とGuide 2]。
参考crisp_bio記事と論文
- CRISPR関連文献メモ_2016/06/05 [第1項] クラス2タイプVI-A CRISPR/CasエフェクターC2c2の標的は一本鎖RNAである
- 2018-03-17 これまでで最小かつヒト細胞で活性なCas13dの同定と解析２報 (Salk研；Arbor Biotechnologies/NCBI)
- 2018/02/23 CRISPRによる核酸検出・診断 (DETECTRとSHERLOCK)
- [4] "We then annealed complementary RNA oligos to regions flanking the crRNA target site. This partially double-stranded RNA (dsRNA) substrate was not cleaved by LshC2c2, which suggests that it is specific for ssRNA" Omar O. Abudayyeh et al. “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector” Science 2016-06-02.
- NONCODEデータベース: Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Wan Y [..] Chang HY. Nature 2014-01-30.
- IPknot: fast and accurate prediction of RNA secondary structures with pseudoknots using integer programming. Sato K, Kato Y, Hamada M, Akutsu T, Asai K. Bioinformatics 2011-07-01.
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