[出典] CRISPR-Cas12a enhanced rolling circle amplification method for ultrasensitive miRNA detection. Zhang G, Zhang L, Tong J, Zhao X, Ren J. Microchem J 2020-07-04

 これまで、RCA (ローリングサークル増幅)法に、Cas9またはCas12aを組合せることで、DNAおよび細胞外小胞のmiRNAを高感度で検出する手法が開発されてきたが [1-3]、上海中医薬大学, 重慶大学, 重慶医科大学およびLihuili Hospitalの研究グループは、RCAによる標的miRNAシグナル増幅にCas12aをベースするDETECTR流の核酸検出法を組合せることで、miRNA21の超高感度検出法を確立した。
  • 標的miRNAが、CRISPR-Cas12aシステムのsgRNAに相補的な配列を中央部に組込んだパドロックプローブ (Padlock probe; PLP)の3'と5'の両末端に結合し、T4 DNAリガーゼを介してPLPが環状化することで、miRNAをプライマー、PLPをテンプレートとする等温RCAが進行する。
  • RCA産物は、sgRNA相補的配列が反復した長鎖ssDNAとなり、sgRNA相補的配列を認識したCas12a-sgRNAがssDNAを切断すると同時に、RCA産物とは独立な消光状態のレポータssDNAがCas12aによりトランス切断されて発する蛍光を介して、miRNAの超高感度検出が実現する。
  • 本手法を、MCF-7乳癌細胞株および乳癌患者の血清から分離したエクソソームからのmiRNA-21検出で検証し、RT-qPCRによるアッセイと整合する結果を得た (R2 = 0.979)。
参考文献
  1. RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage (RACE) for highly specific detection of multiple extracellular vesicle microRNAs. Wang R [..] Luo Y. Anal Chem. 2019-12-26. 
  2. CRISPR-Cas12a based internal negative control for nonspecific products of exponential rolling circle amplification. Tian B [..] Hansen MF. Nucleic Acids Res. 2020-01-20. 
  3. New CRISPR-Derived microRNA Sensing Mechanism Based on Cas12a Self-Powered and Rolling Circle Transcription-Unleashed Real-Time crRNA RecruitingWang G, Tian W, Liu X, Ren W, Liu C. Anal Chem. 2020-05-05: Rolling circle transcription (RCT)-unleashed self-recruiting of crRNA by Cas12a (Cas12a-SCR)