[20201124更新] 新型コロナウイルス: 不活性化-増幅-Cas13/SHERLOCKを統合したSHINEシステム : crisp

2020-11-24 更新 Nature Communication 論文の書誌情報とリンクを追加し一部の図を引用

"Streamlined inactivation, amplification, and Cas13-based detection of SARS-CoV-2" Arizti-Sanz J, Freije CA [..] Sabeti PC, Myhrvold C. Nat Commun 2020-11-20. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19097-x; bioRixvと比較すると、SHINEの由来を、"SHERLOCK and HUDSON Integration to Navigate Epidemics"から"Streamlined Highlighting of Infections to Navigate Epidemics"に変更したのが一番大きな改訂のように見える。

2020-08-31 初稿

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[出典] Integrated sample inactivation, amplification, and Cas13-based detection of SARS-CoV-2. Arizti-Sanz J, Freije CA [..] Sabeti PC, Myhrvold C. bioRxiv 2020-05-28. (プレプリント)

[crisp_bio注] Broad Instituteを主とする研究グループの投稿: 共同責任著者のPardis C. SabetiとCameron MyhrvoldはMassachusetts Consortium on Pathogen Readinessのメンバーでもあり、これまでに、SHERLOCKの応用技術を精力的に発表してきた [1-4]。Pardis C. SabetiはSherlock Biosciencesの共同設立者の一人であるが、7月のSARS-CoV-2のスパイクタンパク質の構造・機能解析に関するbioRxiv投稿 [5]にも共同責任著者として加わっている。

　CRISPR技術をベースとするSARS−CoV−2迅速検出法が多々提案されてきたが [6]、検体からのSARS-CoV-2 RNAウイルスの抽出に始まる不連続な多段階の操作が、安全性と効率の観点から課題であった。研究グループは今回、Cas13のコラテラル活性をベースとするSHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)を２段階反応から1段階反応 (1-ステップ)に改変し、SARS-CoV-2に最適化したHUDSON (Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases)を組合せることで、前処理から検出までを安全かつ高速で処理可能としたSHINE (SHERLOCK and HUDSON Integration to Navigate Epidemics*)を開発した。 [* Nat Commun論文では"Streamlined Highlighting of Infections to Navigate Epidemics"に由来する]:

鼻咽頭スワブまたは唾液採取
HUDSONによるウイルス不活性化 (10分) : 化学処理と加熱によりリボヌクレアーゼ (RNases)を不活性化し、ウイルスエンベロープを破壊してウイルス粒子から核酸を溶液中に放出させる手法 [7]
1-ステップSHERLCOK (30-60分): 標的はORF1aを選択; 従来の2-ステップSHERLOCK [(1) RT-RPA; (2) T7転写と, 消光状態にしたssRNA蛍光レポータのCas13aのコラテラル切断による発光]をベースに、逆転写を促進すると思われるRNase Hを加え、さらに、反応条件を最適化することで2-ステップと同等のLoDを実現]
可視化 (< 5分): 波長485 nmの光励起による試験管内蛍光 (520 nm)測定 (LoD 10 cp/μL), またはラテラルフロー・ペーパー・ストリップ上での比色分析 (LoD 100 cp/μL)

　実証実験は、RT-qPCRで判定したSARS-CoV-2陽性患者と陰性患者からの鼻咽頭スワブそれぞれ30検体と20検体で行った [検体からスマホでの判定までのスキームをFig. 3 a-dから左下図へ引用; 比色分析とスマホでの陽性陰性判定をFig. 3 e-hから右下図へ引用]: