[出典] "Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system" Li S, Li X, Xue W, Zhang L [..] Li J, Yang L, Chen LL. Nat Methods 2020-12-07. https://doi.org/10.1038/s41592-020-01011-4

 環状RNA (circRNAs)は、pre-mRNAの成熟過程でスプライシングが通常と逆方向に進行すること
(back-splicing)で形成される。順方向のスプライシングから形成される線状のmRNAsとcircRNAsとは、back-splicingによって生まれる結合 (back-splicing junction: BSJ)サイトの存在を除いて、同一である。

 各遺伝子から生成されるcircRNAsはおおむね少数であるが、哺乳類の脳 [1]やマウスの着床前胚 [2]などで豊富に発現していることが知られている。一方で、circRNAsを標的とする適切な操作手法が存在しなかったことが一因となって、そのノックダウンやノクアウトの手法が確立されたmRNAsに対して、circRNAsの機能解析は遅れていた。

 確かに、shRNAsまたはsiRNAsによるcircRNAsのノックダウンは可能ではあったが、小規模(~10 nt)でも線状mRNAに対して相補性を帯びたRNAiが、由来する遺伝子の発現に影響してしまう課題を抱えていた。また、DNAを標的とするCRISPR-Cas9によるゲノム編集によって、circRNAを形成するエクソン全体を削除する手法またはcircRNAの生合成に必要なイントロン性cis エレメントを削除する試みもあったが、対象とされたcircRNAsはごく限られていた [1, 3, 4]

 Shanghai Institute of Biochemistry and Cell BiologyとShanghai Institutes for Biological Sciencesを主とする研究グループは今回、ssRNAを標的とするCas13ファミリーによるcircrRNAノックダウンを発想した。
  • Cas13a, Cas13bおよびCas13d RNasesは、哺乳類細胞においてgRNA内のスペーサに相補的な配列のssRNAを切断する。
  • Cas13ファミリーによるssRNAの切断は、22-ntから30-ntの長さのスペーサと標的の間で、シード配列領域でのミスマッチを許容せず、RNAiでは実現できない高い選択性を備えている。
  • 研究グループは、BSJをまたぐ配列を標的とするgRNAとCRISPR–RfxCas13dを組み合わせることで、circRNAsとmRNAsを明確に識別することに成功した [* 論文のFig. 1参照]
  • その上で、高発現しているヒトBSJサイトをまたぐ配列を標的とするレンチウイルス・ライブラリーにより、細胞成長に重要でありそのほとんどが細胞型に特異的な一連のcircRNAsと、発癌性circRNAを一種類とを同定した。
  • FAM120A に由来する発癌性circRNA (circFAM120A)は、FAM120Aに由来するmRNAsが翻訳阻害因子IGF2BP2に結合することを阻害し、ひいては、細胞増殖を亢進する。
  • さらに、マウス着床前胚において、RfxCas13d–BSJ-gRNAスクリーンによって、着床前発生を調節するcircMan1a2を同定した。
  • [参考] circRNAsの操作手法の比較 (RNAi/shRBAまたはASOによるKD; CRISPR-Cas9によるKO; CRISPR Cas13によるKD)について、Extende Data Fig.1参照
 [関連論文]
  1. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function.” Piwecka M [..] Rajewsky N. Science 2017-08-11; crisp_bio 2017-09-23 環状RNAがmiRNAsを介して脳機能を調節する
  2. "Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos" Fan X [..] Tang F, Huang Y. Genome Biol. 2015-07-23.
  3. "The Biogenesis of Nascent Circular RNAs" Zhang Y, Sue W [..] Yang L, Chen LL. Cell Rep. 2016-04-19.
  4. "A circular RNA protects dormant hematopoietic stem cells from DNA sensor cGAS-mediated exhaustion" Xiao P, Wang S [..] Fan Z. Immunity. 2018-04-03.