[出典] "A simple method using CRISPR-Cas9 to knock-out genes in murine cancerous cell lines" Ishibashi A [..] Nimura K. Sci Rep. 2020-12-18. https://doi.org/10.1038/s41598-020-79303-0
CRISPR/Cas9が誘導するindelsを介した遺伝子ノックアウトには漏れがある。Indelsが挿入されたエクソンのスキップを介してmRNA/タンパク質を発現、あるいは、スプライシングバリアントを介したmRNA/タンパク質発現する細胞が存在するからである。
遺伝子ノックアウトの漏れを回避する手法として、遺伝子全域を選択マーカで置換する遺伝子ターゲッティングが考えられるが、ターゲッティング・ベクターである5'末端と3'末端に相同組み換え修復用の相同アームを結合した選択マーカを作出する作業には長時間を要する。
大阪大学の研究グループは今回、ターゲッティング・ベクターを構築することなく、標的遺伝子をノックアウトする単純かつ簡易な手法を開発し、SUCCESS (Single-strand oligodeoxynucleotides, Universal Cassette, and CRISPR/Cas9 produce Easy Simple knock-out System)として発表した。
- SUCCESSは、Cas9とgRNAをコードする2種類のpX330プラスミド、２種類の80merのssODN、および、平滑末端の汎用の選択マーカ配列を導入し、最適な抗生物質により強力な選択を掛けることで、標的とする大規模なゲノム領域のターゲッティングを実現する [Figure 1引用右図参照]。
- SUCCESSによって、多倍性のB16F10マウス黒色種細胞株 (~18 kbpの長さのApod 遺伝子)と、ID8-luc2マウス卵巣癌細胞株 (Antxr2 遺伝子)にて、標的遺伝子のホモ型欠損を実現した。
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