[出典] "Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases" Liu TY [..] Doudna JA. medRxiv. 2021-03-25 [プレプリント]. https://doi.org/10.1101/2021.03.19.21253328
 J. A. Doudnaが率いる研究グループは今回、 LbuCas13にT. thermophilus由来のタイプIII CRISPR-CasシステムのCsm6ヌクレアーゼ (TtCsm6)を組み合わせることで、ウイルスRNAを増幅することなく、ポイントオブケア検査に十分な検出感度を実現し, Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem (FIND-IT) として公開した.
 研究グループは先行研究 [*1] で,L. buccalis Cas13 (LbuCas13)とN遺伝子の2ヶ所とE遺伝子を標的とする3 crRNAsをベースとして,SARS-CoV-2感染患者のスワブサンプルからウイルスRNAを抽出増幅することなく直接によって処理しモバイルフォンでの画像処理を経て,200 copies/μLまで30分で検出可能なことを示した.
[*1] [20210216更新] 新型コロナウイルスをCRISPR-Cas13aとモバイルフォン顕微鏡を介してスワブから直接検出 - RNA増幅不要. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy" Fozouni P, Son S, de León Derby MD [..] Fletcher DA, Ott Melanie. Cell. 2020-12-04.https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001
 研究グループは今回,迅速現場検査 (point-of-care testing: POCT)に向けてさらなる高感度化と高速化を目指した.
  • タイプVI CRISPR-CasシステムのCas13エフェクターの他にもRNA切断活性を示すCRISPR-Casシステムが存在する.タイプIII CRISPR-Casシステムの場合は,エフェクターCsmまたはCmrのウイルスRNA認識によって,二次情報伝達分子として機能する環状のテトラ- またはヘクサ- アデニレート(cA4またはcA)が生合成されCsm6のCATF (CRISPR-associated Rossman fold)ドメインに結合し,その結果,リボヌクレアーゼ活性が発揮される [*2]。
  • [*2] CRISPRメモ_2017/08/07 [第3項] バクテリアの獲得免疫機構におけるセカンドメッセンジャー発見. https://crisp-bio.blog.jp/archives/3195733.html
  • 研究グループは今回,ウイルスRNAで活性化したCas13が発揮するコラテラル活性を利用して,Csm6を活性化する二次情報伝達分子を発生させるCas13-Csm6の二連システムを発案し,予備実験を経て,LbuCas13-crRNA複合体とcrRNAの標的RNAに,T. thermophilus Type III-AシステムのCsm6 (TtCsm6)の安定したアクチベータとして機能する化学修飾A4-U6分子を組み合わせたシステムに至った.
  • この手法FIND-ITによって,~30 RNA copies/microliterを20分で検出可能になった.
  • POCTに展開可能なFIND-ITとして,反応チャンバーと37 ̊Cを維持するヒーターを組み込んだマイクロフリュイディスク・チップに蛍光可視化システムを連結した検出器を作出した.
  • SARS-CoV-2の場合,コンパクトな可視化システムによる判定を介して,RNAの精製と増幅を介さない鼻咽頭スワブからのワンステップ分析において,PCRのCt値29相当を達成した.