[出典] "Improved architectures for flexible DNA production using retrons across kingdoms of life" Lopez S, Crawford K, Bhattarai-Kline S, Shipman SL. bioRxiv. 2021-03-26 [プレプリント]. https://doi.org/10.1101/2021.03.26.437017
 近年,細胞内でのゲノムDNAの相同組み換え (HDR)に必要なドーナDNAとして,細胞外で合成したDNAを細胞に導入する手法に替えて,細胞内で目的とするDNAを生成する手法が開発されて来た.2021-03-30 20.17.41その一つが,レトロンを利用して,逆転写酵素 (reverse transcriptase: RT)を介して細胞内でゲノム編集用のDNA (以下,RT-DNA (reverse transcribed))を生成する手法である [*][1-5]
[*]  REVIEW "Retrons and their applications in genome engineering" Simon AJ, Ellington AD, Finkelstein IJ. Nucleic Acids Res. 2019-10-10. https://doi.org/10.1093/nar/gkz865 のFigure 1 https://academic.oup.com/view-large/figure/185741751/gkz865fig1.jpg 引用上図参照
 RT-DNAは汎用性の高いカセットから細胞内で大量生産することが可能なことから,高精度ではあるが効率が極めて低いHDRを介したゲノム編集の効率を高めることを期待できる
Gladstone Instituteの研究チームは今回,ゲノム編集効率をさらに高め,バクテリアと酵母に続いてヒト細胞株においてもレトロン効果を発揮するレトロンの最適化を実現した
レトロン・オペロンは,ファージ に対する防衛機能を担う1種類またはそれ以上のアクセサリータンパク質に続くノンコーディングRNA (ncRNA) とRTで構成され,ncRNAがRTのプライマーおよび逆転写のテンプレートとして機能する.ncRNAは上図Aの中のmsrとmsdに相当し,転写後,上図Bにあるようなヘアピン構造をしたRT-DNAへと転写される.ただし,msrはRT-DNA分子において,RNAのままステム構造を形成する [図の中のa1 resionとa2 regionはそれぞれステム構造部分の3'末端と5'末端相当する].
  • 大腸菌の変異体ライブラリーを利用して,RT-DNAの大量生成に,ncRNAに由来するステムの長さに下限があり,また,a1/a2の間の相補する領域の長さにも下限があることを見出した.
  • ステム長としては,野生型の25 bpに対して,<12 bp または > 30 bpの長さの変異体におけるRT-DNA生産量が2分の1未満となった.
  • さらに,a1/a2相補性領域を拡大することで,バクテリアと酵母においてRT-DNA生産量を上げることが可能なことを同定した.
  • 改良型レトロンにより,ヒト細胞株におけるRT-DNA生産が実現したが,a1/a2相補性領域拡大の効果は見られず,RT-DNAの複雑な構造の転写抑制機構など,ヒト培養細胞におけるその分子機構の解明が課題として残った.
 [関連crisp_bio記事4件とbioRxiv投稿1件]
  1. 2018-02-02 CRISPRによる細胞事象記録システム:mSCRIBE、TRACEそしてCAMERA. https://crisp-bio.blog.jp/archives/7431834.html;  "Genomically encoded analog memory with precise in vivo DNA writing in living cell populations." Science. 2014-11-14. https://doi.org/10.1126/science.1256272
  2. 2019-10-22 [20200508更新] David R. Liuグループからプライムなゲノム編集法 - BEsに続くPEs. https://crisp-bio.blog.jp/archives/20458334.html; "Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA" Anzalone AV [..] Liu DR. Nature 2019-10-21. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4 - prime editing guide RNA (pegRNA) 
  3. CRISPRメモ_2018/09/24 [第1項] CRISPEY:超並列精密ゲノム編集による機能ゲノミクス. https://crisp-bio.blog.jp/archives/12408819.html; "Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing" Sharon E,  Chen  SAA, Khosla NM, Smith JD, Pritchard JK, Fraser HB. Cell. 2018-09-20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.08.057 - CRISPEY (Cas9 Retron precISe Parallel Editing via homologY) "研究チームは、E. coli Ec86レトロンのバクテリアレトロン配列を100-ntの長さの相同組換えドナーと相同アームの配列に置換し、3'末端にsgRNAを結合することで、核内で相同組換え用ドナーとなるssDNAsを大量に生成するCRIPEYを実現した (Retron-guide RNAとdonor-guide RNAの構造について原論文Figure 1-A https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0092867418311188-gr1_lrg.jpg 参照)。
  4. CRISPRメモ_2020/01/04 [第4項] CRISPRシステムとレトロン・システム併用により、大腸菌における多重な置換変異の誘導、そのトラッキングおよび機能スクリーニングを実現. https://crisp-bio.blog.jp/archives/21445468.html; "Multiplex generation, tracking, and functional screening of substitution mutants using a CRISPR/retron system" Lim H, Jun S [..] Lee H, Bang D. ACS Synth Biol. 2020-04-29. https://doi.org/10.1021/acssynbio.0c00002
  5. "High throughput functional variant screens via in-vivo production of single-stranded DNA"  Schubert MG, Goodman DB [..] Church GM. bioRxiv. 2020-03-06. https://doi.org/10.1101/2020.03.05.975441