重慶大学からの論文
[出典] "Target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of CRISPR/Cas13a (TITAC-Cas) for detection of alkaline phosphatase" Wang X, Zhou S [..] Huo D, Hou C. Biosens Bioelectron. 2021-04-27. https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113281

 DETECTRやSHERLOCKのようなCas12aやCas13aのコラテラル活性をベースとする超高感度核酸検出システムは,標的分子をそれぞれの基質となるssDNAやssRNAに変換することで,任意の標的分子の超高感度検出へと展開可能である [*1, *2]
  • 著者らは今回,SHERLOCKの手法 [*3]を,アルカリホスファターゼ (alkaline phosphatase; ALP)の超高感度検出へと展開し,その手法を"target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of Cas13a" (TITAC-Cas)として発表した.
  • TITAC-Casには,ALPの存在下でCas13aのコラテラル活性を誘導するssRNAが産生されるような"target-induced transcription amplification"の仕掛けが組み込まれている.すなわち,ALPの基質として,5'末端がリン酸化されているT7プロモーターとCas13a-crRNAが認識可能なcrRNAと相補的なssRNAを転写物として生産するdsDNAからなるコンストラクト,5'P-dsDNA,を用意する.
  • ALP非存在下では,T7プロモーターがラムダエキソヌクレアーゼによって分解されdsDNAがssRNAへと転写されない.一方で,ALP存在下では,5′P-dsDNAが5′OH-dsDNAへと変換され,転写が進行し,ssRNAを認識したCas13aのコラテラル活性が発揮され,FQ-レポータの切断と発光を誘導する.
  • TITAC-Casは,こうしてALPの触媒作用,T7の転写増幅,およびCas13aのssRNAトランス切断の三種類のシグナル増幅を介して,ALP活性の超高感度検出を実現した.検出限界は6 ± 0.52 mU/Lで,線形増幅範囲は0.008 - 250 U/Lに及んだ.また,TITAC-CasはHepG2細胞溶解液中でのALP活性測定にも高性能を発揮した.
 [Cas12aとCas13aによる超高感度検出システム関連crisp_bio記事]