[出典] "In-depth assessment of the PAM compatibility and editing activities of Cas9 variants" Zhang W, Yin J [..] Hu J. Nucleic Acids Res. 2021-06-16. https://doi.org/10.1093/nar/gkab507
[注] PEM-seqは北京大学の著者らが先行研究において開発した"LAM-PCR HTGTSにターゲットシーケンシングを組み合わせた"ハイルスープットなprimer-extension-mediated sequencing法を意味する [*].
研究グループは，野生型SpCaa9, 高忠実度Cas9 改変体 (SpCas9, eCas9, HF1, FeCas9, evo, HiFi, Hypa, LZ3, Sniper)とPAMの制限を緩やかにしたPAM-felxible Cas9改変体 (Cas9-NG, xCas9, SpG, SpRY)について，複数の標的部位における編集効率，特異度およびPAM適合性を評価した．
- PAM-flexible SpCas9改変体については、オフターゲット活性が有意に増加していた．
- 特にPAM-lessに近いSpRYについては、ターゲティング範囲と編集特異性がトレードオフの関係にあった．
- SpRYについては深層学習モデルを用いて，オフターゲット部位の整合性と予測性を検証した。
- 高忠実度Cas9改変体とSpRYを組み合わせることで，高忠実度と広範囲な編集を可能とした新たなSpCas9改変体を3種類作出した: eCas9-SpRY; HF1-SpRY; Hypa-SpRY．
- 既存のCas9改変体はSpCas9と同様に．編集によって誘発されるゲノムの不安定性を抑制する効果が無いことを明らかにした
- Cas9改変体の性能とデリバリー法との相関についての解析が必要なことも指摘した．
[*] LAM-PCR HTGTとPEM-seqの開発論文と応用例紹介crisp_bio記事
- LAM-PCR HTGT: "Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases" Frock RL, Hu J, Meyers RM, Ho Y-J, Kii E, Alt FW. Nat Biotechnol. 2014-12-15. https://doi.org/10.1038/nbt.3101
- PEM-seq: "Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing" Yin J, Liu M, Liu Y, Wu J, Gan T, Zhang W, Li Y, Zhou Y, Hu J. Cell Discov. 2019-03-26. https://doi.org/10.1038/s41421-019-0088-8
- crisp_bio 2021-02-23 CRISPR-Cas9利用時にはDSBからの修復がもたらす有害な副産物に注意. https://crisp-bio.blog.jp/archives/25659895.html
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