[出典] "Distribution and phasing of sequence motifs that facilitate CRISPR adaptation" Santiago-Frangos A, Buyukyoruk M, Wiegand T, Krishna P, Wiedenheft B. Curr Biol. 2021-06-25. https://doi.org/10.1016/j.cub.2021.05.068; [GRAPHICAL ABSTRACT] https://marlin-prod.literatumonline.com/cms/attachment/ea23895a-a818-45d8-a969-11db30019121/fx1_lrg.jpg
[前置き]
CRISPR-Casシステムにおける侵入DNAの断片を獲得しCRISPRアレイに組み込むアダプテーション (adaptation)の分子機序については，J. A. Doudnaが率いる研究グループが，生化学的実験と構造解析に基づくモデルを2016年から2017年に提唱していた．
CRISPR-Casシステムにおける侵入DNAの断片を獲得しCRISPRアレイに組み込むアダプテーション (adaptation)の分子機序については，J. A. Doudnaが率いる研究グループが，生化学的実験と構造解析に基づくモデルを2016年から2017年に提唱していた．
すなわち，E. coli in vivo において、組込み宿主因子 (integration host factor, IHF) と呼ばれるアクセサリータンパク質が、ATリッチなCRISPRリーダー配列に結合して鋭く折り曲げたところに、侵入DNAの断片 (プレスペーサまたはプロトスペーサと呼ばれる)を捕捉・獲得したCas1-Cas2タンパク質複合体が結合することで，直近に獲得したプロトスペーサーを，スペーサとしてリーダー配列に隣接したリピート配列の直下に組み込み可能とする．
[出典] "CRISPR Immunological Memory Requires a Host Factor for Specificity" Nuñez JK [..] Doudn JA. Mol Cell. 2016-06-16. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.04.027; Figure 1参照 https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1097276516301034-gr6_lrg.jpg
"Structures of the CRISPR genome integration complex.” Wright AV, Liu JJ, Knott GJ, Doxzen KW, Nogales E, Doudna JA. Science. 2017-09-15. https://doi.org/10.1126/science.aao0679; Fig.S16. Model for repeat recognition and integration by Cas1-Cas2. page 26 in Supplementary Materials. https://science.sciencemag.org/content/sci/suppl/2017/07/19/science.aao0679.DC1/aao0679_Wright_SM.pdf
[PERSPECTIVE] "Crystal-clear memories of a bacterium" Globus R, Qimron U. Science. 2017-09-15. https://doi.org/10.1126/science.aao4929; Figure "The CRISPR memorization process" 参照. https://science.sciencemag.org/content/sci/357/6356/1096/F1.large.jpg
[成果]
大腸菌 (E. coli K12株)内在のサブタイプI-E CRISPRシステムでは、先頭のリピート配列の6 bp上流から始まる~30 bpの配列モチーフにIHFが結合することが知られていたが，研究グループは，緑膿菌 (P. aeruginosa PA14)内在のサブタイプI-F CRISPRシステムでは，IHFの結合部位が，6 bp上流ではなく14 bp上流に位置していることを見出していた．この差の意味を明らかにすることを目的として研究グループは今回，バクテリアとアーケアのゲノムをCRISPRDetectで解析し，それぞれ，14,095件と1,179件の合計15,274件のCRISPR遺伝子座を同定し，その上流200 bpにおけるIHF結合部位を探索した．
- 15,274リーダー配列において，8,631件のIHF結合部位候補を同定した．続いて，冗長なリーダ配列を除去し残った6,533件のリーダー配列について，CRISPR-CasサブタイプにわたるIHF結合部位の分布を分析した．
- IHF結合部位の存在率は，サブタイプのI-C，I-E，I-F，およびII-Cについてそれぞれ，24%, 26&%, 83%，および32％となった．
- 興味深いことに，サブタイプI-F，I-E，II-CおよびI-Cのリーダー配列のそれぞれ，53%，6%, 6%, および3%が多重なIHF結合部位を帯びていた．
- 各サブタイプに特有のモチーフが高頻度に見られ，モチーフの配列，間隔，および向きがサブタイプ内およびサブタイプ間で異なり，識別したリーダー構造は~20種類に至った．
- 近縁種間のリーダー配列の違いは，10～12bp程度の挿入や欠失（インデル）を伴うことが多く，これによってモチーフの位相が保たれていることから，アダプテーションについては，距離そのものよりも位相が重要であることが示唆された [Figure 4. Phase-dependent CRISPR adaptation 参照. https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0960982221007958-gr4_lrg.jpg]。
- さらに，in vitro アダプテーションアッセイを用いて，緑膿菌由来のサブタイプI-F CRISPRシステムのアダプテーションにおいて、リーダーモチーフの配列と位相の両方が重要であることを検証した。
- 今回のデータは全体として，CRISPRシステムのアダプテーションの分子機構は多様であるが，IHFに依存するシステムはすべて位相依存性であることを支持した．
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