[出典] "Visualization and characterization of RNA–protein interactions in living cells" Duan N, Arroyo M, Deng W, Cardoso MC, Leonhardt H. Nucleic Acids Res. 2021-07-27. https://doi.org/10.1093/nar/gkab614
2021-07-31 11.47.47 Ludwig Maximilians University MunichとTechnical University of Darmstadtの研究グループは今回,Figure 1 から引用した右図Aに概要が示されているRNA fluorescent three-hybrid (rF3H)を開発し,標題を実現した:
  1. MS2コートタンパク質 (MCP),Lacリプレッサー (LacI),およびEGFPからなるRNAトラップを介して,哺乳類細胞株のゲノムに組み込んだバクテリアのlacオペロン (lacO)アレイにRNAを捕捉する.
  2. MCPはms2ステムループでタグ付けされた関心のあるRNA (RNA of interest, ROI)に結合し,融合させておいたLacIタンパク質を介して,ROIをlac0遺伝子座に固定する.
  3. 一方で,RFPやmCherryなどの赤色蛍光タンパク質で標識したRNA結合タンパク質 (図の中のprotein of interest, POI)は,トラップされたROIとの相互作用を介してlacOアレイにリクルート・濃縮される.
  4. 上述の組み合わせにより,蛍光顕微鏡下で核内のlacOアレイでの緑色と赤色の蛍光の共局在を見ることで,RNA-タンパク質間相互作用の検出と追跡が可能になる [Figure 1引用上図のB, pp7 RNAとPCPコートタンパク質 (mCherryで標識)の例を参照].
 2021-07-31 11.55.03[参考] Graphical Abstract
  • RNAトラップをベースとするRNA-タンパク質間相互作用アッセイ法の原理,応用,および拡張 (右図参照)
 rF3Hアッセイの最適化に続く検証
  • ポリアデニル化したmRNAミミックとPABP1の相互作用
  • 長鎖ノンコーディングRNA /lncRNA, NORD,とPUMILIO 2 (PUM2)タンパク質の相互作用判定
  • HOTAIR (HOX transcript antisense intergenic RNA)とPolycomb抑制複合体2 (PRC2)の主要構成因子であるヒストンメチル基転移酵素EZH2との相互作用領域同定 [Figure 3Figure 4参照 ]
 rF3Hアッセイの拡張
  • Lac0アレイに替えて,RNA結合ユニットをラミンB1タンパク質に融合することで,HeLa細胞の 核内膜にRNAを結合 [Figure 5参照]
  • PUMILIOファミリータンパク質 (PUM)のPumilio and FBF homology (PUF)ドメインを介したRNAトラップ [Figure 6 A-E参照 ]
  • CRISPR^dCas13aをベースとするRNAトラップ [Figure 6 F-I 参照]