[出典] "Endogenous protein tagging in medaka using a simplified CRISPR/Cas9 knock-in approach" Seleit A, Aulehla A, Paix A (EMBL). bioRxiv. 2021-07-29 [プレプリント] https://doi.org/10.1101/2021.07.29.454295
 著者らは,メダカ (Oryzias latipes )において,CRISPR/Cas9による相同組換え修復を介した内在性タンパク質のタギングのために,簡略,高効率で,かつ,正確なCRISPR/Cas9ノックイン法を開発した.
  • 蛍光レポーター配列を含むPCR増幅ドナー断片をビオチン化し,短い (30-40bp)ホモロジーアームに挟んで使用することで,クローニングやin vivo 線形化を不要にした.
  • この手法により,高効率なF0ターゲティングおよび生殖細胞への伝達を実現した.
  • 6種類の新規ノックイン系統を作出し,それぞれの特徴を明らかにした.WGSおよび標的とした遺伝子座のサンガーシーケンシングにより,標的遺伝子座でのみシングルコピーの組み込みが進行したことを確認した.
  • ノックイン系統は,内在性のユビキタスな核標識や組織特異的なレポーターを生成するだけでなく,細胞内輸送やストレス顆粒 (stress granule)形成などの細胞プロセスを胚発生期に4Dで記録することを可能にし,メダカで利用可能な遺伝学的ツールキットを大幅に拡張した.
  • 特に,内因性のmScarlet-pcna ノックイン系統が,任意の組織または器官における増殖細胞のラベリングおよび内因性細胞周期レポーターとして機能することを示した.