2024-03-14 論文の筆頭著者と責任著者による解説記事を以下に紹介:血液脳関門 (BBB) を通過可能なAAVウイルスを介して, 脳全域でのCRISPR-Cas9ゲノム編集を実現した観点からの解説
[出典] Behind the paper "CRISPR throughout the brain: Brain-wide genome editing via BBB-crossing AAV virus alleviates amyloid-related pathologies in mice" Ip NY, Duan Y. SPRINGER NETURE Research Communities. 2021-08-24. https://communities.springernature.com/posts/crispr-throughout-the-brain-brain-wide-genome-editing-via-bbb-crossing-aav-virus-alleviates-amyloid-related-pathologies-in-mice?badge_id=nature-biomedical-engineering

 
まず、PX601ベースのAAV-Cas9コンストラクトを採用し、その中でサイトメガロウイルス (CMV)プロモーターをより小型のEFS (elongation factor 1-alpha short)プロモーターに変更し、AAV9に組み込み、海馬内注射によって脳細胞に高効率で感染させた。その結果、ウイルス感染した脳領域でAPPスウェーデン変異が効率よく編集されることを確認できた (ゲノム編集効率は30%程度)。

 次に、Cas9コンストラクトをBBBを通過可能なAAV変異体であるAAV-PHP.eBにパッケージした。このAAV-PHP.eB-Cas9システムの全身投与した際は、編集イベントは検出できず、少数の脳細胞でCas9タンパク質が検出されたのみであった。しかし、このAAV-PHP.eBパッケージ化Cas9ウイルスとGFPウイルスを共注入したところ、GFPのシグナルが強く見られた。これらの結果から、Cas9のウイルス・コンストラクトは、低いウイルスコピー数ではうまく発現できず、Cas9の発現がほとんど検出されないことが示唆された。

 Cas9とGFPは2つのウイルスコンストラクトで駆動され、その発現シグナルに大きな違いがあったことから、これらのウイルス発現コンストラクトを比較し、Cas9を発現するウイルス・コンストラクトに重要な要素が欠落していないかどうかを調べた。その結果、Cas9コンストラクトはWoodchuck Hepatitis Virus (WHP)の転写後制御エレメント(WPRE)の配列を含んでいないことがわかった。しかし、Cas9-WPREコンストラクトのサイズがAAVウイルスのパッケージ限界(約5kb)を超えるため、WPREの全長をCas9コンストラクトに挿入することは技術的に不可能であった。その時点で、WPREの様々な切断型に関する論文に出会った [Mol Brain 2014]。

 切断型WPREを利用することで、Cas9タンパク質の発現が有意に増強された。さらに、海馬局所内注入の編集効率と比較して、この改変システムは複数の脳領域で同様の編集率を達成した。さらに、ニューロン特異的ヒトシナプシン1 (Syn) プロモーターを用いて、ニューロンを特異的に標的とするようにこのコンストラクトを改良した。これらの最適化を経たニューロン特異的ゲノム編集システムは、BBBを超えて効果的で効率的な脳全体のゲノム編集を達成する。概念実証研究では、この脳全体のゲノム編集戦略により、APPスウェーデン変異を破壊することに成功し、脳全体のアミロイド病態の緩和や認知機能の改善などの有益な結果をもたらすことが実証された。

 著者らが知る限り、これは改変AAV変異体を用いた成体段階での脳全体のゲノム編集の最初の実証であった。この脳全体にわたるゲノム編集戦略は、筋萎縮性側索硬化症 (C9orf72遺伝子の変異によって引き起こされ、一次運動皮質、脳幹、脊髄の運動ニューロンが冒される) やパーキンソン病(LRRK2、PARK7、PINK1、PRKNs、SNCA遺伝子の変異によって引き起こされ、海馬、視床、前帯状回に影響を及ぼす) など、複数の部位が冒される他の単発性脳疾患に適用することができる。

2021-08-03
Nature Biomedical Engineering 誌刊行論文に準拠した初稿
[出典] "Brain-wide Cas9-mediated cleavage of a gene causing familial Alzheimer’s disease alleviates amyloid-related pathologies in mice" Duan Y, Ye T [..] Ip NY. Nat Biomed Eng. 2021-07-26. https://doi.org/10.1038/s41551-021-00759-0
 香港科技大学を主とする研究グループからの論文:
  • 家族性アルツハイマー病は,アミロイドベータ前駆体タンパク質 (APP)およびプレセニリン1とプレセニリン2をコードする遺伝子の顕性変異によって発症し,脳の複数の領域における細胞外アミロイド斑と細胞内の神経原線維変化を特徴とする疾患である.
  • ヒトAPP Swedish変異を帯びたトランスジェニックマウスの脳全域において,変異したAPP対立遺伝子を選択的に破壊した.Cas9とその変異を標的とするsgRNAの双方をコードするAAVを海馬内に1回投与した後,少なくとも6カ月間はアミロイドベータ関連の病態が緩和されることを見出した.
  • また,血液脳関門 (BBB) を通過できるように改良したAAVを用いてCRISPR-Cas9コンストラクトを静脈内に投与することで,アミロイドベータの沈着,ミクログリオーシス,神経突起ジストロフィー,および認知能力の低下などがすべて改善されることを見出した.
 家族性アルツハイマー病をはじめ,複数の脳領域に影響を及ぼす単発性疾患の治療には,脳全体を対象としたゲノム編集が有効であると考えられる。