2022-03-28 Nature Commnication 誌から刊行された論文の書誌情報と，関連crisp_bio記事と論文を追記し，テキストを一部改訂した [実験結果の改訂は無い]．
2021-08-16 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "Harnessing DSB repair to promote efficient homology-dependent and -independent prime editing" Peterka M, Akrap N, Li S, Wimberger S [..] Maresca M. bioRxiv. 2021-08-10. Nat Commun. 2022-03-24. https://doi.org/10.1038/s41467-022-28771-1
プライムエディティング (PE)は，Cas9ニッカーゼをベースとして開発されたが，その後，Cas9ヌクレアーゼ版が開発されてきた [＊ 1, 2]．AstraZenecaの研究グループは今回，SpCas9ヌクレアーゼをベースとして，DNA二本鎖切断 (DSB)修復過程を介して．正確なゲノム挿入を実現する戦略を2種類開発し，PEn (SpCas9 nuclease-based prime editor)として発表し，PEのツールボックスを拡充した．
[オリジナルPEの機序 (右図参照)]
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Cas9ニッカーゼによる標的部位のニッキング - ニックの３’末端に，pegRNAのプライマー結合部位 (primer-binding site)がハイブリダイズする．
- プライミングされたニックの3'末端が，pegRNA内のRT (逆転写酵素)とテンプレート (RT template with edit)によって伸長され，目的とする編集を含むフラップ配列が生成される
- フラップの標的遺伝子座とのハイブリダイゼーションとライゲーションにより，フラップが標的遺伝子に組み込まれる．
1．SpCas9ヌクレアーゼに従来型のpegRNAを組み合わせたPEn (右下図左参照)
- ホモロジー依存的なDSB修復機構を介して，短いゲノム挿入が効率的に促進された．
- このPEnは，想定外の編集結果を増やしたが，配列のアライメントから解析したところでは，そのほとんどがRTテンプレートの挿入が繰り返された結果であった．
- "想定外の編集結果"は，NHEJの重要なメディエーターであるDNA-PKを阻害することで抑制することに成功した．
- PEnは一方で，Cas9ニッカーゼをベースとするPEでは機能しなかったpegRNAを活性化した．
2．SpCas9ヌクレアーゼに改変型pegRNAを組み合わせるPRimed INSertions strategy (PRINS)
- 従来型のpegRNAに対して，ホモロジーテールを除去しPBSと挿入すべき配列のみで構成されるsingle primed insertion gRNA (springRNA)を採用し，ホモロジーに依存せずに，非相同末端接合経路 (NHEJ)を介したゲノム編集を試みた [右上図右参照]。
- PRINSによって目的とする挿入が実現し，PRINSによる挿入はDNA-PK阻害剤によって完全に阻止された．HEK293T細胞，HeLa細胞，およびHCT116細胞における編集効率は，RTテンプレートと標的DNA配列に依存するが，最大50%に達した．
- 目的以外の挿入は，テンプレートより短縮された挿入と，gRNAのスキャフォールドが加わってテンプレートよりも長い挿入が見られた．
Cas9ヌクレアーゼによる遺伝子編集では，Cas9の標的部位周辺にキロベースに及ぶ大規模な欠失が頻繁に発生することが知られている．しかし，PEnの場合は，大規模な染色体欠失が抑制されることを見出した．さらに，Cas9編集による望ましく無い大規模欠失のメカニズムの一つとし，NHEJによる標的遺伝子座の正確な修復を介してCas9の切断が反復されることを，示唆した．
[＊] Cas9ヌクレアーゼをベースとするPE関連crisp_bio記事
- 2021-10-15 PEDAR: PE (プライムエディティング)による長いゲノム配列の削除と置換を実現. https://crisp-bio.blog.jp/archives/27673120.html; "Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing" Jiang T, Zhang X-O, Weng Z, Xue W. Nat Biotechnology 2021-10-14. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01026-y [PEDAR: PE-Cas9-based deletion and repair]
- [20210920更新] プライム・エディティング (PE)のオールインワン化と，ヌクレアーゼ版PE．https://crisp-bio.blog.jp/archives/26840850.html; "Optimized nickase- and nuclease-based prime editing in human and mouse cells" Adikusuma F [..] Thomas PQ. Nucleic Acids Res. 2021-09-17. https://doi.org/10.1093/nar/gkab792
- [20200508更新] David R. Liuグループからプライムなゲノム編集法 - BEsに続くPEs. https://crisp-bio.blog.jp/archives/20458334.html
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