CRISPR-Casシステムの臨床応用にあたっては，オンターゲットでの編集活性向上，オフターゲットでの編集活性抑制などとともに，小型化が課題であり，天然の小型Casの探索や改変やgRNAの改変が試みられてきた．2021年の9月2日と3日に相次いで，Nature Biotechnology 誌とMolecular Cell 誌から，アーケア由来で哺乳類細胞ではほとんど活性を示さなかった小型 (422-603 aa)のCas12fをベースとして，さらにコンパクトでかつ哺乳類細胞において高活性を示すCRISPR-Casシステムを実現した論文が発表された．それぞれ，韓国KRIBBのGenome Editing Research Centerのグループ (1/2)とdCas9技術を切り拓いてきたスタンフォード大学のLei S. Qiグループ (2/2)の成果である．
超小型Cas12f1と人工ガイドRNAをアデノ随伴ウイルス (AAV)で送達することで，効率的CRISPR編集を実現
[出典] "Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus" Kim DY, Lee JM  [..] Kim YS. Nat Biotechnol 2021-09-02. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01009-z; "CRISPR-Cas12f_GE system: Big things come in small package" Kim YS. A community from natureportfolio. 2021-09-02.https://bioengineeringcommunity.nature.com/posts/big-things-come-in-small-packages
  • アーケア由来のCas12f (Un1Cas12f1)は，これまでに発見された最も小型のCRISPR関連ヌクレアーゼ (Cas)の一つであるが，真核細胞では極めて低い活性しか示さなかった．研究グループは，crRNAの3′末端，sgRNAのスキャフォールド (tracrRNA)の5'末端，tracrRNA-crRNA相補領域，tracrRNA内のペンタウリジニル酸)(UUUUU)配列，tracrRNAのステム2領域の5ヶ所の部位を再設計 [論文Fig. 1参照 https://www.nature.com/articles/s41587-021-01009-z/figures/1]した相乗効果により，indels誘導頻度を867倍へと向上させることに成功した．
  • これは，crRNAの3'末端へのU-リッチな配列結合が活性にプラスに働き，tracrRNAにおけるU-リッチ配列は活性にマイナスに働くという興味深い結果であった．また構造的に無秩序であったステム2領域は，Casとの結合に不要であり，これを削除することで，Cas12f1が安定な二量体を形成する可能性も明らかになった．
  • この5ヶ所の再設計にはgRNAのサイズを大幅に縮小する効用もあった．
  • 最適化Un1Cas12f1システムを，プラスミドベクター，PCRアンプリコ，およびAAVで送達することで，ヒト細胞において効率的かつ特異的ゲノム編集を実現した．
  • Un1Cas12f1システムは，プロトスペーサの外側でDNAを切断することから，dsDNA切断-NHEJ経路の複数回にわたる持続的な切断をサポートし，大規模な欠失を効率的に誘導することも発見した．
  • Un1Cas12f1システムは，SpCas9と同等の効率とAsCas12aと同等の特異性を示した．
  • 本論文でKRIBBなどと共著のGenkOre社は，Cas9の~3分の1のこのシステムを"Hypercompact"なCRISPR/Cas12f-GEとしてプレス発表した．   
 [関連crisp_bio記事]