2022-08-26 Nature 刊行論文の書誌情報を追記：
"R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9" Pacesa M [..] Jinek M. Nature 2022-08-24. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05114-0
2021-09-16 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "Mechanism of R-loop formation and conformational activation of Cas9" Pacesa M, Jinek M.
"R-loop formation and conformational activation mechanisms of Cas9" Pacesa M [..] Jinek M. Nature 2022-08-24. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05114-0
2021-09-16 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "Mechanism of R-loop formation and conformational activation of Cas9" Pacesa M, Jinek M.
CRISPR-Cas9ゲノム編集システムの発見・発明に貢献しJennifer A. Doudnaと多数の共著論文を発表し，その後，University of Zurichに職を得たMartin Jinekが率いるチームの投稿．
- SpCas9の標的となるDNAとの結合や，標的配列とオフターゲット配列の識別の正確なメカニズムはまだ，完全には解明されていない．
- 長短のターゲット配列 (6-, 8-, 10-, 12-, 14-, 16-, 18-, および 20-bp)とdCas9-sgRNAの三者複合体の構造をクライオ電顕法により再構成した．10-bpの相補的配列と結合した三者複合体についてはX線結晶構造解析も行った．
- その結果，Cas9の活性化と二重鎖DNA切断に必要なコンフォメーション変化が明らかになった．すなわち，PAMの遠位におけるヘテロ二重鎖，R-ループ，およびPAMの近位におけるヘテロ二重鎖の形成と，Cas9のドメインの動き，および両者の連動の機序が詳らかにされた．
- 6-ntのターゲットは，Tyr450とのスタッキング相互作用により，5-bpのR-ループを形成するだけであり，さらに塩基対が形成されるとR-ループが変位していく．
- Cas9とターゲットの結合初期には，Cas9のREC2ドメインとREC3ドメインが正電荷を帯びたクレフトを形成し，そこに，DNA基質のPAM遠位二重鎖が入り込んでいる．
- 10-ntのシード領域全体と塩基対が形成されると，端が中央の結合チャネルへとシフトし，RECローブが再配置され，REC2とREC3の2つの高電荷で保存されているヘリックスが接近する．
- Rループがシード領域を超えて伝播すると，HNHドメインがRuvC-PIの界面から外れていき，この間，Cas9の活性部位は内部に埋め込まれていて，早期の切断が回避されている．
- 16bpのR-ループが形成されると，RuvCとHNHの間のリンカーが再構築され、HNHドメインが標的鎖 (TS)に向かって大きく移動する．しかし，活性部位はまだ切断部位から離れており，不完全な標的鎖のペアリングでは，ヌクレアーゼドメインの活性化に必要なコンフォメーション変化が進行しないことを意味した．
- 20bpのR-ループが形成されると、HNHドメインが切断部位に向かって140度回転する．これにより，非標的鎖 (NTS)がRuvCの触媒ポケットに再配置されると考えられ，この機序でTSとNTSの両鎖が同時に切断されることが示唆された．
[関連crisp_bio記事] Cas9の結合，PAMのチェックに続く標的DNAのチェックの初期段階の動態
- 2021-09-11 CRISPR-Cas9はDNAを曲げ捻ることでその配列を読み取る.https://crisp-bio.blog.jp/archives/27375609.html; "CRISPR-Cas9 bends and twists DNA to read its sequence" Cofsky JC, Soczek KM, Knott GJ, Nogales E, Doudna JA. (bioRxiv. 2021-09-07) Nat Struct Mol Biol 2022-04-14. https://doi.org/10.1038/s41594-022-00756-0
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