[注] SARS-CoV-2の標的配列の設定と変異株のゲノム配列から，アルファ，ベータ，ガンマ，およびデルタの各変異株も検出可能と推定している．
[出典] "Detection of Infectious Viruses Using CRISPR-Cas12-Based Assay" Talwar CS [..] Kang T, Woo E. Biosensors. 2021-08-28. https://doi.org/10.3390/bios11090301
[出典] "Detection of Infectious Viruses Using CRISPR-Cas12-Based Assay" Talwar CS [..] Kang T, Woo E. Biosensors. 2021-08-28. https://doi.org/10.3390/bios11090301
韓国KRIBBを主とする研究グループは今回，3種類のCas12a (Cpf1)タンパク質 [*] のコラテラル活性を比較評価した上で，LbCas12a酵素を選択し，検出法として，蛍光法とラテラルフローアッセイ (LFA)の2種類を採用したCRISPRdxを開発した [Fig. 1引用右図 a 参照]．[*] LbCpf1, AsCpf1, および EeCpf1 [Figure 2参照]
- SARS-CoV-2の標的選択にあたっては，SARS-CoVとの差別化に留意して，スパイクタンパク質のACE2受容体結合部位内の2ヶ所のCas12a PAM配列TTTNに隣接する20-ntの配列を選択し [上図 b 参照]，加えて，臨床サンプルコントロールとしてヒトRNase PのPOP7遺伝子を加えた．
SARS-CoV-2を対象として，サンプルあたりウイルス10コピーの検出限界を実現した．また，12人のCOVID-19患者と8人の健常者の正確な診断を実現した [Figure 4引用右図参照]．- さらに，このアッセイがMERS-CoVやSARS-CoV (2002年~2003年)の検出に展開可能なことを示した．
- 本システムをPOCT (Point Of Care Test)に適合するには例えばワンチューブ化などが必要であるが，CRISPR-CasによるSARS-CoV-2のPOCT (point of care test)システムと同レベルの検出感度であることを確認した [Table 1を下図に引用し，その引用文献のリストを列記]．
- なお，SARS-CoV-2の標的配列の設定から，アルファ，ベータ，ガンマ，およびデルタの各変異株を検出可能と考えている．
[38] CODA (CRISPR Optical Detection of Anisotropy), Cas12a: “Fluorescence polarization system for rapid COVID-19 diagnosis” Lee CY, Degani I, Cheong J, Lee JH, Choi HJ, Cheon J, Lee H. Biosens Bioelectron. 2021-01-30. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33540323/；DETECTR流の読み出し部分に蛍光異方性を採用した新型コロナウイルスの迅速診断法．https://crisp-bio.blog.jp/archives/25504588.html- [39] CASdetec (CRISPR-assisted detection), Cas12b: “SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics” Guo L, Sun X, Wang X, Liang C, Jiang H, Gao Q, Dai M, Qu B, Fang S, Mao Y, et al. Cell Discov 2020-05-19. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34006843/
- [40] PGM (personal glucose meter)-CRISPR, Cas12a: “CRISPR-Cas12a-derived biosensor enabling portable personal glucose meter readout for quantitative detection of SARS-CoV-2” Huang D, Shi Z, Qian J, Bi K, Fang M, Xu ZA. Biotechnol. Bioeng. 2021-02-04. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33410130/
- [41] Cas12a: “Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a” Xiong D, Dai W, Gong J, Li G, Liu N, Wu W, Pan J, Chen C, Jiao Y, Deng H. et al. PLoS Biol 2020-12-15. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33320883/
- [42] CRISPR-FDS (RT-RPA CRISPR-Fluorescent Detection System), Cas12a: “A smartphone-read ultrasensitive and quantitative saliva test for COVID-19” Ning B, Yu T, Zhang S, Huang Z, Tian D, Lin Z, Niu A, Golden N, Hensley K, Threeton B, et al. Sci. Adv. 2021-01-08. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33310733/; 唾液からのCOVID-19 POCTシステム - 唾液から判定まで15分．https://crisp-bio.blog.jp/archives/25072356.html
- [43] POC-CRISPR, Cas12a: “Point-of-care CRISPR-Cas-assisted SARS-CoV-2 detection in an automated and portable droplet magnetofluidic device” Chen FE, Lee PW, Trick AY, Park JS, Chen L, Shah K, Mostafa H, Carroll KC, Hsieh K, Wang TH. Biosens. Bioelectron. 2021-06-02. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34171821/; Cas12aをベースとして新型コロナウイルス検査を鼻咽頭スワブの溶出液から20分で完了する可搬型デバイスを開発．https://crisp-bio.blog.jp/archives/25529674.html
- [29] DETECTR, Cas12a: “CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2” Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, et al. Nat. Biotechnol. 2020-04-16. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32300245/; 新型コロナウイルス：Mammoth Biosciences, DETECTRに基づく簡易キット開発へ．https://crisp-bio.blog.jp/archives/22225033.html
- [44] SHERLOCK, Cas13a: “Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA” Patchsung M, Jantarug K, Pattama A, Aphicho K, Suraritdechachai S, Meesawat P, Sappakhaw K, Leelahakorn N, Ruenkam T, Wongsatit T, et al. Nat. Biomed. Eng. 2020-08-26. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32848209/; 新型コロナウイルス: Cas13をベースとするSARS-CoV-2 RNA検出法の臨床評価 (SHERLOCK). https://crisp-bio.blog.jp/archives/24025973.html
[crisp_bioレビュー紹介記事]
- 2021-06-02 [展望] CRISPRをベースとする診断ツール．https://crisp-bio.blog.jp/archives/26516309.html
- 2020-12-04 [レビュー] CRISPRをベースとするバイオセンシング・システム: COVID-19のPOCTに向けてへの道．https://crisp-bio.blog.jp/archives/24936690.html
- 2020-06-13 [レビュー] CRISPR技術によるSARS-CoV-2迅速検出法．https://crisp-bio.blog.jp/archives/23298366.html
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