2021-12-27 Science Report 誌刊行論文の書誌情報を追記し，Research Square 投稿からの引用図をScience Report 誌からの引用図に差し替え，本記事のテキストも一部改訂した．
2021-10-02 初稿
[出典] "Short term but highly efficient Cas9 expression mediated by excisional system using adenovirus vector and Cre" Nagamoto S [..] Kanegae Y. Sci Rep 2021-12-21.https://doi.org/10.1038/s41598-021-03803-w
"Short-Term and Highly Efficient Cas9 Expression System Using Adenovirus Vector and Site-Specic Recombinase Cre" 永本紗也佳 [..] 鐘ヶ江裕美. Research Square. 2021-09-22 [プレプリント; Science Reports誌にて査読中]. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-900410/v1;
[出典] "Short term but highly efficient Cas9 expression mediated by excisional system using adenovirus vector and Cre" Nagamoto S [..] Kanegae Y. Sci Rep 2021-12-21.https://doi.org/10.1038/s41598-021-03803-w
"Short-Term and Highly Efficient Cas9 Expression System Using Adenovirus Vector and Site-Specic Recombinase Cre" 永本紗也佳 [..] 鐘ヶ江裕美. Research Square. 2021-09-22 [
慈恵医科大学と東京理科大学の研究グループからの投稿
[背景]
- CRISPR/Cas9の送達法として，in vitroではプラスミドトランスフェクションやエレクトロポレーションが広く用いられているが，トランスフェクション効率が低い細胞では高い編集効率が得られず，受精卵を除いて生体内での応用は困難であり，生体内への送達には，ウイルスベクターが適用されている．
- しかし，最も広く利用されているエフェクターSpCas9のDNAサイズは約4.3kbと，アデノ随伴ウイルス (AAV)ベクターの挿入DNAサイズを超えるため，SaCas9のように小型のCas9 DNAが選択されている．レンチウイルスベクターを利用したSpCas9発現が可能であるが，AAVベクターもレンチウイルスベクターも長期発現ベクターのため，dsDNA切断活性を帯びたCas9の連続的発現がオフターゲット効果のリスクを高めるリスクを伴う．
- 一方で，アデノウイルスベクター (AdV)は，AdV自体の炎症効果が報告されているためか，Cas9の送達に利用された例が少ないが，AdVの炎症効果は，遺伝子発現用プロモーターを選択することで容易に抑制可能である．AdVの課題はむしろ，目的遺伝子の発現が少なくとも6カ月間継続する点にある．
[成果]
研究グループは，SpCas9とCAGプロモーターを改変したCBhプロモーターの配置を，gRNA G2-G3/Cre AdVのCreを介して発現可能な配置に変える[＊]ことで，短期的かつ強力なCas9発現を実現し，Exci-Cas9，として発表した [Fig. 1引用右図 a 参照]- [＊]プロモーターの上流にcas9 を配置したExci-Cas9 AdVと，Creを組み込んだgRNA (gRNA/Cre Adv)を送達し，Creを投与することで，Exci-Cas9からcas9 とプロモーターからなる環状発現ユニット形成を介して，Cas9が発現するに至る．
- Exci-Cas9によって，SpCas9の発現期間を6ヶ月から短縮することに成功した．
- 肝癌由来細胞株HuH-7において，Exci-Cas9によるB型肝炎ウイルスのゲノム破壊効率が，AdVからのCas9の直接発現 [Avec: 右図 b 参照]と同レベルの約80〜90％に達することを確認した．
- Exci-Cas9はまた，細胞や組織に特異的なプロモーターからCreを発現させることで，細胞や組織の選択的ゲノム編集を可能にする．
- Exci-Cas9は，Cas9の持続的発現の課題を解決しただけでなく，ヒトパピローマウイルスなどの長期的なDNAウイルスの排除にも有用であると考えている．
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