（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/01/23）
- [論文] 非対称なDNAドナーを利用すると、CRISPR/Cas9を介したHDRの効率が向上する：Jacob E. Corn (Innovative Genomics Initiative, UC Berkeley)
- バイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry: BLI）やゲルシフトアッセイを利用してCas9によるdsDNAの切断機序を詳細に観察した結果に基づいて、Cas9とCas9ニッカーゼによるHDR(相同組換え修復)の効率を60%まで向上させ、また、不活性化したCas9（dCas9）についても、標的DNAにおけるバブル構造形成を介して、0.7%までのHDR率をもたらす手法を開発した．本手法は、比較的短い領域の遺伝子修復に有用である．
- [Cas9によるdsDNAの切断機序と新手法] Cas9は、sgRNAに誘導されてdsDNAに結合し、その２つのヌクレアーゼドメインHNHとRuvCによって、それぞれ、sgRNAの標的ストランド（targeted strand, 以下 TS）と非標的ストランド（以下、NTS）を切断する．Cas9がその後dsDNAから遊離する速度は遅く６時間程度かかるが、完全に遊離する前に、PAMから遠い方のNTSの断片だけが先に遊離し始める（Cas9が、PAMに近いNTS側と、切断されたTSの両側に結合している間に）．
- 先に遊離し始めるssDNAに相補的な部位を有する適切な長さのドナーDNAを設計する事で、HDR率を大幅に改善することに成功．
- [論文] CRISPR/Cas9とCre/Loxシステムの併用によって、抗ウイルス・ワクチンの開発期間を大幅に短縮 ：Qigai He & Gang Cao (華中農業大学)
- 中国において最近アウトブレイクを起こした再興（re-emerging）ブタ仮性狂犬病ウイルス（Pseudorabies virus：PRV）ワクチンを、今回、短期間で開発することができたが、この手法は、HBV, HSVなどのDNAウイルス全般に適用可能であり、また、CRISPR/Cas技術に進歩に拠って、RNAウイルスワクチンの開発にも展開可能である．
- CRISPR/Cas9を介した相同組換え修復（HDR）を利用して、再興したPRV（PRV HNX）の病原性遺伝子２種類、TK とgE 、を同時にそれぞれ、loxNで挟んだmCherryと、loxPで挟んだGFPに置換することで、PRV-HNKから、mCherryとGFPをCreで除去した組換えウイルスPRV-HNK-TK-/gE- を導出．一細胞FACSを利用したウイルス精製の効率化も利用．
- 作出した組換えウイルスのワクチン候補はブタに障害を与えず、また、有効であることをブタ生体で確認できた．
- 従来のワクチン作出手法であれば、２種類の病原遺伝子を削除したワクチン候補を作出するためには、長時間を要するプラーク・アッセイによる精製を20回程度繰り返す必要があった．今回の手法は、CRISPR/Cas9による2遺伝子置換のsテップ、Vre/Loxによるマーカ遺伝子削除のステップ、それに、わずかに４回のプラーク精製を要するだけである．
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