[出典] SPOTLIGHT "New Type III CRISPR variant and programmable RNA targeting tool: Oh, thank heaven for Cas7-11" Catchpole RJ, Terns MP (U Georgia). Mol Cell. 2021-11-04. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.10.014

　著者らは，CRISPR-Casシステムの基本に続いて，Science 誌とNature 誌にて相次いで発表されたタイプIII CRISPR-Casシステムの中でも特徴ある「サブタイプ III-Eシステム」*の構成と機能を，手際良く解説し，高効率かつ高精度なRNAターゲティングを可能とするシングルエフェクターCRISPR-Casシステムの自然界からの発見に今後も期待するとした．
[*] サブタイプIII-Eシステムは，Makarovaら(Nat Rev Microbiol, 2019)のレビューでCRISPR-Casシステムの分類体系に，III-V, IV-B, およびIV-Cとともに初めて加えられたサブタイプ [Fig. 1参照]．

 

 [タイプIII-E CRISPR-Casシステムの構成] Figure 1 参照

　Özcanら [1]は，完全ゲノムとメタゲノムの配列データから116億種類のタンパク質配列を探り出し，合計17種類のサブタイプIII-Eシステムを同定した．他のすべてのタイプIIIシステムのエフェクターがクラス1のマルチサブユニット複合体であるのに対し，タイプIII-Eシステムのエフェクターは，タンプIIIシステムのカノニカルなCas7とCas11のサブユニットが単一のポリペプチドに融合したと想定された．このポリペプチドを，ÖzcanらはCas7-11と称し [1]，van BeljouwらはgRAMP (giant repeat-associated mysterious protein)と呼んだ [2](以下，ここではCas7-11に統一する)．RT-cas1  を伴っていることは，Cas7-11がRNAからスペーサを獲得する (adapitationのステップ)ことが示唆されるが，スペーサー獲得に通常必要とされてきたCas2は，サブタイプIII-Eシステムにはほとんどに見られず (存在を確認できたのは1例だけ)，スペーサー獲得の機構には謎が残っている．

　大多数のタイプIIIシステムでは，CRISPRアレイの転写産物が，アクセサリータンパク質の一種であるCas6によって成熟したcrRNAへと加工される．一方，サブタイプIII-Eでは，Cas7-11が単独でcrRNAの転写産物をcrRNAへと成熟させる，これは，タイプVのエフェクターCas12とタイプVIのエフェクターCas13を彷彿とさせる．成熟したcrRNAは，ターゲットRNAを認識する約20 ntのガイド要素，14～28 ntの範囲で長さが異なる5′ CRISPRリピートセグメントで構成される．サブタイプIII-Eシステムの間で興味深いことに，直接反復RNAの最後の14ntが極めてよく保存されていることから、14ntのcrRNAの5′タグ要素が，Cas7-11タンパク質との相互作用の認識モチーフであることが示唆された．Özcanらは，さらに一歩進んで，直接反復RNAによって形成されるヘアピンの予測される膨らみが切断部位であると認識した．

　Cas7-11のcrRNA生合成活性は，ターゲットRNAの切断活性と独立し，金属イオンに依存せず，ターゲットRNA切断活性が消失する突然変異があっても進行する．一方、ターゲットRNAの切断は金属イオンに依存し，配列特異性が高く，Cas7ドメインによって6 nt離れた2つの部位で行われる．この6ntの間隔は，隣接するCas7サブユニットの物理的な間隔に起因し，標準的なタイプIIIシステムによる切断を彷彿とさせる．このことは，Cas7-11は，遺伝子構成が独特であるが、祖先エフェクター以来の構造的特徴を維持している可能性がある．Cas7-11がターゲットとする2ヶ所の切断部位の内，一方の部位にはCas7度メインに保存されている特定のアスパラギン酸残基が必要なことが示されたが，４種類のCas7ドメインそれぞれの機能解明はこれからである．

　これまで知られていたタイプIIIシステムは，アクセサリータンパク質Csm6/Csx1を介して，ターゲットRNA結合時に環状オリゴアデニル酸 (cOA)を二次情報伝達分子として生成しコラテラル活性を示すが，Cas7-11にはcOA産生能が存在しない．サブタイプIII-Eシステムのアクセサリータンパク質については，一部，既知のタンパク質との配列相同性が見られるが，RNAターゲティングには必要ではなく，それぞれの機能解析も，4種類のCas7ドメイン同様，これからである．

　Özcanらは，大腸菌と哺乳類細胞において，Cas7-11単独でmRNAを編集可能なことを示した．配列特異的なターゲティングによりノックダウンされ，タンパク質の発現も低下した．さらに，Cas7-11システムの特異性は、ショートヘアピンRNAを用いた古典的なRNAiやCRISPR-Cas13ツールに比べて，哺乳類細胞におけるオフターゲット効果が著しく少ないことを同定し，Cas7-11が優れたRNAノックダウン用ツールになる可能性が示された．ただし，ノックダウン効率は，細胞の種類，ガイドRNA，ターゲットRNAなどによって大きく変動した (25～80％)．また，Cas7-11にアデノシンデアミナーゼ (ADAR2)を融合させることで，生体内でRNAの部位特異的なA-to-I変換を実現したが，変換効率は転写産物の2%–8% に留まった．

　Cas7-11エフェクターのスペーサ獲得と標的切断の分子機構，アクセサリータンパク質の役割，crRNAの最適化，エフェクタの改変などによる編集効率の向上など，課題がまだまだあるが，今回の2論文は，自然界に存在するゲノムおよびメタゲノムの決定とマイニングが，新たなCRISPR-Casシステムの発見と新たなゲノム編集ツールの発明に重要なことを示した．

RESEARCH HGILIGHT "Expanding RNA target effectors" Tang L. Nat Methods 2021-11-03. https://doi.org/10.1038/s41592-021-01323-z; crisp_bio 2021-11-10 [ハイライト] RNAを標的とするエフェクターが拡大された．https://crisp-bio.blog.jp/archives/27866315.html